NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH

Luận án tiến sĩ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH.Dây thìa canh (DTC) (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.),thuộc chi Gymnema R.Br, phân bố rất rộng từ Tây Châu Phi sang Châu Úc,Châu Á. DTC đã đƣợc sử dụng trong nền Y học cổ truyền Ấn Độ từ hơn 2000 năm để điều trị Đái tháo đường (ĐTĐ), cho đến nay có hàng trăm nghiên cứu tại Ấn Độ và nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Ấn Độ, Nhật Bản, M , Trung Quốc…liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, trong đó chủ yếu là tác dụng hạ đƣờng huyết cũng nhƣ một số bệnh lý chuyển hóa khác.

Tại Việt Nam, Dây thìa canh bắt đầu đƣợc tập trung nghiên cứu từ năm 2008, trên các khía cạnh đa dạng sinh học, phân bố, độc tính, tác dụng hạ đƣờng huyết, từ đó nghiên cứu phát triển tạo ra nhiều sản phẩm hạ đƣờng huyết dƣới dạng viên nang, viên nén, dạng trà túi lọc và cả dạng dƣợc liệu khô đóng gói để sắc uống. Nhằm bảo đảm nguồn nguyên liệu, DTC cũng đã đƣợc nghiên cứu nhân giống, trồng trọt. Đến năm 2015, đã có 2 vùng trồng đạt tiêu chuẩn GACP
– WHO của công ty Nam Dƣợc tại Hải Hậu (Nam Định) và của công ty DK Natura tại Phú Lƣơng (Thái Nguyên).
Trong quá trình phát triển và ứng dụng trong thực tiễn DTC có nguồn gốc tự nhiên ở Việt Nam, xuất hiện nhiều vấn đề chƣa đƣợc làm sáng tỏ như thành phần hóa học khác so với DTC ở Ấn Độ, khó đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu dựa trên hàm lƣợng hoạt chất, xác định thời gian thu hái cho chất lƣợng tốt nhất trong trồng trọt,… Lý do chính là thiếu các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các chất trong DTC. Từ những lý do trên, đề tài ‖Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.)‖ đƣợc
thực hiện với 2 mục tiêu chính:
1. Xác định cấu trúc hóa học các thành phần hóa học chính của lá Dây thìa canh Việt Nam.2
2. Xác định sự thay đổi hàm lượng một số hoạt chất chính theo thời gian thu hái trong năm của lá Dây thìa canh

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………………………………………… 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN……………………………………………………………………………. 3
1. THỰC VẬT HỌC………………………………………………………………………………. 3
1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R. Br…………. 3
1.2. Chi Gymnema R. Br. ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài……………. 6
2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI
GYMNEMA R. Br……………………………………………………………………………………….. 7
2.1. Nhóm hợp chất saponin……………………………………………………………………… 7
2.2. Các nhóm chất khác ………………………………………………………………………… 19
3. TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT VÀ CHỐNG TĂNG LIPID HUYẾT
CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R. Br………………………………. 20
3.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết…………………………………………………………………. 20
3.2. Tác dụng chống tăng lipid huyết……………………………………………………….. 25
4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT
SAPONIN TRONG MỘT SỐ DƢỢC LIỆU ………………………………………………. 28
4.1. Phƣơng pháp định lƣợng và đánh giá động thái tích lũy hoạt chất ……………… 28
4.2 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo tuổi cây………………………………………………….. 28
4.3. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời gian thu hái trong năm……………………… 29
4.4. Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời điểm sinh trƣởng và bộ phận của cây…. 30
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….. 33
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU…………………………………………………. 332.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ……………………………………………………………………… 33
2.1.2. Vật liệu, dung môi, hóa chất ……………………………………………………………….. 34
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu …………………………………………… 35
2.1.4. Động vật thực nghiệm dùng trong nghiên cứu ………………………………………. 37
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………… 38
2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học…………………………………………………………… 38
2.2.1.2.Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập……………………………………….. 38
2.2.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học……………………………………………………………… 38
2.2.2.1. Phƣơng pháp điều chế mẫu dịch chiết DTC cho thử tác dụng hạ đƣờng
huyết…………………………………………………………………………………………………………….. 39
2.2.2.2.Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột của dịch chiết Dây thìa
canh ……………………………………………………………………………………………………………… 39
2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập đƣợc…………. 41
2.2.2.3.1. Phƣơng pháp xác định khả năng ức chế enzym PTP1B của hoạt chất. … 41
2.2.2.3.2. Phƣơng pháp biệt hóa tế bào mô mỡ 3T3-L1 …………………………………… 42
2.2.2.3.3. Phƣơng pháp đo độ hấp thu glucose trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các
chất phân lập. ………………………………………………………………………………………………… 43
2.2.2.3.2.4. Phƣơng pháp chụp ảnh tế bào phát huỳnh quang …………………………… 43
2.2.2.3.5. Phƣơng pháp phân tích kết quả………………………………………………………. 43
2.2.3. Nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất trong lá Dây thìa canh ………………. 44
2.2.3.1. Phƣơng pháp thủy phân và xác định cấu trúc aglycon …………………………. 44
2.2.3.2.Phƣơng pháp định lƣợng aglycon và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất 44
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………………….. 46
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC …………………. 46
3.1.1. Chiết xuất và phân lập các chất tinh khiết từ Dây thìa canh…………………….. 46
3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập đƣợc …………………………….. 483.1.2.1. Chất 1 ……………………………………………………………………………………………. 48
3.1.2.2. Chất 2 ……………………………………………………………………………………………. 52
3.1.2.3. Chất 3 ……………………………………………………………………………………………. 55
3.1.2.4. Chất 4 ……………………………………………………………………………………………. 58
3.1.2.5. Chất 5 ……………………………………………………………………………………………. 61
3.1.2.6. Chất 6 ……………………………………………………………………………………………. 65
3.1.2.7. Chất 7 ……………………………………………………………………………………………. 66
3.1.2.8. Chất 8 ……………………………………………………………………………………………. 69
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC……………………. 74
3.2.1. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột………………………. 74
3.2.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập ……… 85
3.3.2.1.Hoạt tính ức chế enzym PTP1B…………………………………………………………. 85
3.2.2.2.Hoạt tính hấp thu glucose trong tế bào 3T3-L1 của các chất …………………. 86
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT……. 88
3.3.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc aglycon gymnemagenol…………… 88
3.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng gymnemagenol và theo dõi động thái tích
lũy hoạt chất trong DTC………………………………………………………………………………….. 96
3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu dƣợc liệu và khảo sát điều kiện phân tích ……………………… 96
3.3.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống…………………………………………………. 98
3.3.2.3. Độ lặp lại của phƣơng pháp ……………………………………………………………… 98
3.3.2.4. Khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp…………………………………….. 99
3.3.2.5. Độ đúng của phƣơng pháp ………………………………………………………………100
3.3.2.6. Giới hạn của phƣơng pháp………………………………………………………………101
3.3.2.7. Định lƣợng gymnemagenol các mẫu Dây thìa canh theo các tháng thu hái102
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN…………………………………………………………………………….106
4.1. VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ………………………………………………………1064.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ……………………………………………………….107
4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ……………………………………………………………112
4.3.1. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của dịch chiết Dây thìa canh……………………..112
4.3.2. Về tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất phân lập từ Dây thìa canh ………115
4.4. VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT………………………………………117
4.5. BÀN LUẬN CHUNG …………………………………………………………………………119
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………………………121
1. Về thành phần hóa học …………………………………………………………………………121
2. Về tác dụng sinh học …………………………………………………………………………….122
3. Về động thái tích lũy hoạt chất ……………………………………………………………..122
ĐỀ XUẤT……………………………………………………………………………………………………124
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC