PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TỪ MÁU DÂY RỐN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP LY TÂM CÓ SỬ DỤNG HES

(Umbilical cord blood stem cell isolation by centrifuge method using HES solution)

 

NGUYÊN LÝ

Các phân tử của dung dịch HES (Hydroxy Ethyl Starch) liên kết với hồng cầu làm tăng tỷ trọng, khi ly tâm phức hợp này nhanh lắng xuống trước, để lại lớp có nhiều tế bào có nhân.

Nguồn gốc kỹ thuật: theo quy trình kỹ thuật của Hiệp hội Ngân hàng máu Mỹ (AABB).

CHỈ ĐỊNH

Các mẫu máu dây rốn sau thu thập đạt tiêu chuẩn xử lý.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Các mẫu không đạt tiêu chuẩn.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện: được đào tạo kỹ thuật phân lập tế bào gốc.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện:

Tủ an toàn sinh học;

Tủ lạnh 4^oC;

Máy ly tâm lạnh;

Bàn ép túi máu; máy hàn dây; kìm vuốt dây túi máu;

Máy lắc túi máu;

Cân điện tử;

Máy phân tích huyết học > 18 thông số;

Bộ túi xử lý máu dây rốn;

Hộp đựng bông tiệt trùng;

Kìm kẹp dây túi máu;

Đồng hồ bấm giây;

Bơm và kim tiêm các loại;

Ống đựng mẫu xét nghiệm;

Tất cả các dụng cụ phải được hấp tiệt trùng.

Hoá chất

Dung dịch HES 6%;

Cồn 70^o;

Chai cấy vi trùng vi nấm;

Hóa chất tiệt trùng bàn xét nghiệm, dụng cụ.

Tất cả các môi trường hoá chất đều đã được tiệt trùng.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Túi máu dây rốn (MDR) được sát trùng bằng cồn 70^o chuyển vào phòng xử lý. Quá trình xử lý tiến hành trong phòng sạch cấp độ B.

Chuẩn bị mẫu để ly tâm lần 1:

Cân túi MDR lần 1 trừ bì (gồm túi và chất chống đông);

Dán barcode và ghi các thông tin vào hồ sơ xử lý;

Hàn dây túi thu thập MDR, bỏ đi các đoạn dây không cần thiết;

Đặt túi MDR lên máy lắc đều 5 phút;

Sát trùng bên ngoài túi MDR chuyển vào tủ an toàn sinh học;

Gắn kim lấy mẫu vào miệng túi máu;

Lấy mẫu xét nghiệm: Tổng phân tích tế bào máu, cấy vi khuẩn, vi nấm;

Cân lại túi máu và tính lượng HES cần dùng;

Bơm HES với tốc độ 0,5ml/giây

Lắc trộn đều trong vòng 10phút;

Ly tâm lần 1:

Chuyển túi MDR vào cốc ly tâm, tính toán đối trọng cho mẫu ly tâm;

Ly tâm lần 1: lực ly tâm 150G trong 5 phút, ở nhiệt độ 10^oC.

Chuẩn bị mẫu ly tâm lần 2:

Đưa bàn ép túi máu, cân điện tử, bộ túi xử lý vào tủ an toàn sinh học;

Đặt túi MDR sau ly tâm vào bàn máy ép, gắn đầu kim túi xử lý vào túi MDR, đặt túi chuyển 1 lên cân điện tử. Ép túi MDR chuyển phần huyết tương và phần buffy – coat vào trong túi chuyển 1 cho đến khi lớp hồng cầu vừa tới miệng túi chuyển 1 thì bắt đầu tính lượng hồng cầu lấy thêm. Lượng hồng cầu lấy thêm được tính như sau:

Lượng HES thêm vào	Lượng RBC cần chuyển
17 gram
20 – 29 ml	18 gram
30 – 39 ml	19 gram
> 40 ml	20 gram

 

Khi thêm đủ lượng hồng cầu vào thì khoá van, mở bàn ép và trả phần hồng cầu ở đoạn dây vào túi MDR, hàn và tách rời túi MDR khỏi túi xử lý;

Tính trọng lượng của MDR trong túi chuyển 1 (P1): Trọng lượng túi xử lý trừ bì.

Ly tâm lần thứ 2:

Xếp bộ túi xử lý vào cốc ly tâm và cân bằng đối trọng;

Ly tâm lần thứ 2: lực ly tâm 400G trong 10 phút, ở nhiệt độ 10^oC.

Chuẩn bị mẫu để lưu trữ:

Chuẩn bị 7ml dung dịch bảo quản: dung dịch DMSO + dung dịch Dextran T40 với tỷ lệ 1: 1 vào ống kim tiêm 20 ml để vào tủ lạnh ở 4^oC;

Đặt túi chuyển 1 sau ly tâm vào bàn ép, đặt túi huyết tương lên cân điện tử, ép túi chuyển 1 để đưa huyết tương tới miệng túi huyết tương, bắt đầu tính lượng huyết tương lấy ra: P1 trừ đi hằng số cố định 24.9g;

Sau khi lấy đủ lượng huyết tương, dùng kìm vuốt phần huyết tương còn ở đoạn dây trả lại vào túi chuyển 1; hàn cắt rời túi chuyển 1;

Cân sản phẩm: trọng lượng túi chuyển 1 trừ bì (trọng lượng túi xử lý);

Trộn đều túi sản phẩm và lấy 1ml sản phẩm để xét nghiệm CD34 và tổng phân tích tế bào máu.

Kết thúc quy tình:

Bàn giao sản phẩm, mẫu lưu và mẫu xét nghiệm đánh giá;

Hoàn thiện và lưu hồ sơ.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Melissa Croskell, Kathy Loper, David H.McKenna. HES sedimentation for Manual Red Cell Removal, in Basic Cellular therapy manufacturing procedures, Method 26 – 2; Cellular Therapy: Principle, Method and Regulation. Bethesda, MD: AABB, 2009, chapter 26, p.312 – 314.