Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu thành phần, cỡ cấu loài của ký sinh trùng sốt rét và tính đa hình di truyền của plasmodium falciparum tại tỉnh Quảng Bình

Những nghiên cứu VC thành phần, cơ cấu loài, phân tích kiểu gen xác định tính đa hình bằng kỹ thuật PCR có độ nhạy và chính xác cao nhằm đặc trưng những quần thể KST, mô tả động học của chúng và xác định những yếu tố chi phối ảnh hưởng qua lại của KST với vật chủ trong một vùng dịch tễ nhất định sẽ làm thuận tiện cho phương pháp phòng chống sốt rét có hiệu quả.
Áp dụng kỹ thãiật PCR, chúng tôi đã phân tích 254 mẫu máu bệnh nhân nhiễm KSTSR tại Quảng Bình. Kết quả đã phát hiện được 3 loài KSTSR trên người. Tỷ lệ nhiễm đơn chiếm 70%. Trong đó nhiễm đơn do p.falciparum chiếm 47,6%, nhiễm đơn p.vivax là 22,4%, nhiễm phối hợp chiếm 30%. Chỉ có 2 trường hợp bệnh nhân nhiễm phối hợp 3 loài.
Để làm sáng tỏ về tính phù hợp của kỹ thuật PCR trong phân tích quần thể KSTSR, 3 locus gen đa hình của 3 loại protein của p. falciparum ( MSP1 – đoạn 2, MSP2 – đoạn 3, GLURP – vùng II) được lựa chọn cho phản ứng PCR. ADN thu nhận từ bệnh nhân nhiễm p. falciparum thu thập tại 4 huyện sốt rét lưu hành thuộc tỉnh Quảng Bình dùng làm khuôn cho kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên Agarose gel để xác định các đoạn đa hình. Kích thưóc của các đoạn đa hình được xác định bằng hệ thống xử lý ảnh Imaging systems SDS – 8000 với phần mềm LabWork 4.0. Phân tích 113 mẫu bệnh nhân nhiễm p. falciparum phát hiện được 33 biến thể alen của MSP! đoạn 2, trong đó KI có 17 biến thể alen (kích thước sản phẩm PCR 142~295bp), MAD20 có 15 biến thể alen (kích thước sản phẩm PCR 106-24.1 bp), R033 chí có 1 biến thể duy nhất 160bp; 26 biến thể alen của MSP2 – đoạn 3 trong đó FC có 10 biến thể alen (kích thước sản phẩm PCR 220-550bp), IC có 16 biến thể alen (kích thước sản phẩm PCR 423-603bp); 13 biến thể alen của GLURP (kích thước sản phẩm PCR 470- 1154bp.
So sánh kiểu gen của p. falciparum tại huyện Lệ Thuỷ trong 2 năm 2004 và 2005 không có sự khác biệt.
Trên cơ sở phân tích tẩn suất alen trong các locus gen, kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm đa alen ( MOI – Multiplicity of infection )[46| khá cao. Trong đòng gen KI, MOI=1.34; MAD20. MOI=1.37; FC, MOI=2.()4; ĨC, MOI=L61; GLURP, MOI=l,61. Kết quả này cho thấy tần suất lan truyền trong vùng này rất cao.
ĐẶT VÂN ĐỂ
Dịch tễ học bệnh sốt rét là ảnh hưởng qua lại của 3 yếu tố: Ký sinh trùng sốt rét (KSTSR), con người và vectơ (muỗi Anophen) truyền bệnh, Đặc trưng quần thể KSTSR và sự phân bố của chúng trong quần thể người và muỗi truyền bệnh trong một khu vực nhất định sẽ cho chúng ta hiểu được về dịch tễ học, bệnh học, và sinh học của loài ký sinh trùng (KST) này.    ^    I
Bệnh sốt rét là bênh truyền nhiễm qua trung gian truyền bệnh là loài muỗi Anophen. Cho đến nay, bệnh sốt rét vẫn là mối hiểm họa của hàng triệu người trên thế giới. Theo báo cáo của Tổ Chức Y tế Thế Giới [11], hiện có 107 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lưu hành, với dân số khoảng 3,2 tỉ người. Hàng năm có từ 350-500 triệu người mắc, hơn 1 triệu người tử vong vl sốt rét, phần lớn là phụ nữ và trẻ em ở Châu Phi.[11]
Yiệt Nam nằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng của thế giới, là một trong những nước có nguy cơ cao về bệnh sốt rét.
Quảng Bình là tỉnh miền trung, thuộc vùng sốt rét lưu hành nặng của Việt Nam, phía bắc giáp Nghệ An, phía nam giáp Quảng Trị, phía tây là biên giới chung vói Lào. Dân số toàn tỉnh 832407, trong đó số dân nằm trong vùng sốt rét lưu hành 468716. về hành chính, Quảng Bình có 7 huyện, trong đó 4 huyện Iiằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng là Bố Trạch, Lệ thủy, Quảng Ninh và Minh hoá. Hàng năm chương trình Quốc gia phòng chống sốt rét chi phí hàng trăm tỉ đồng cho 7 tỉnh sốt rét trọng điểm trong cả nước, trong đó có Quảng Bình. Tuy nhiên tỉ lệ mắc bệnh sốt rét vẫn ở mức cao. Theo thông báo của Trung tâm phòng chống sốt rét Quảng Bình năm 2004, tỉ lệ mắc sốt rét: chung trong toàn tỉnh là 5,06/1000 dân số chung. Nguyên nhân thì nhiều. Một trong những nguyên nhân chính là hệ thống y tế thôn bản yếu kém. Kỹ thuật phát hiện KSTSR hạn chế. VI vậy không thể phát hiện, phân biệt đầy đủ và chính xác thành phần, cơ cấu các loài KSTSR trong một bệnh nhân, đặc biệt những trường hợp có mật độ nhiễm KST thấp hoặc nhiễm phối hợp hai hay nhiều loài, trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số lượng.
Trong công tác phòng chống sốt rét, việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh trên người bệnh là một khởi đầu quan trọng cho việc đề ra các biện pháp đúng giải quyết sau đó, nhất là những vùng có bệnh sốt rét. lưu hành cao, lây nhiễm gối tiếp nhau thường xuyên, xảy ra liên tục quanh năm giữa vật chủ
(người) và vectơ (muỗi) truyền bệnh. Do quá trình lây truyền và nhiễm bệnh hết sức phức tạp, làm cho mật độ nhiễm các loài KSTSR trong máu bệnh nhân và muỗi truyền bênh không đổng đồu, nên kính hiển vi thường không thổ phát: hiên, phân biêt đầy đủ và chính xác thành phần, cơ cấu các loài KST trong bênh nhân sốt rét tại thời điểm lấy máu.
– Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử đã đạt đến trình độ cao hiện nay là sử dụng kỹ thuât phản ứng chuỗi Polymerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) [17,25,26]. Kỹ thuật có độ nhạy và chính xác cao, có khả năng phát hiện được những trường hợp có mật độ nhiễm KST thấp (< 1 KST/fil máu)[21,26].
KSTSR có các gen tương ứng nằm rải rác trên những nhiễm sắc thể khác nhau và chỉ gặp một lần trong hệ gen đơn bội ở giai đoạn hồng cầu. Một số gen kháng nguyên có những khác biệt nhỏ ( những đoạn lặp lại ) trong chuỗi ADN tạo nên tính đa hình. Nhiều tác giả trôn thế giới đã dựa vào tính đa hình của Plasmodium falciparum với hy vọng: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch với những kháng nguyên xác định [13]. Nghiên cứu những biến động của KST [14]. Nghiên cứu quần thể KST [15]. Nghiên cứu tái tổ hợp giới tínhỊ 16, 17].
Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại giúp phát hiện các cấu trúc đặc thù của ABN. Những thành tựu nghiên cứu cấu trúc và chức Iiăng ADN trong những năm gần đây đã đưa lại những ứng đụng thực tiễn hết sức đa dạng và có giá trị cao. Từ việc phát hiện tài nguyên di truyền tiềm ẩn trong phân tử ADN của các loài sinh vật đến việc xác định đặc trưng cá thể, chẩn đoán bênh, vốn là những việc mà trước đây đòi hỏi nhiều công sức, thời gian, lại không chính xác, thì nay nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, đã trở liên dễ dàng , nhanh chóng và chuẩn xác hơn rất nhiều.
Để góp phần xác minh, bảo tổn có hiệu quả đa dạng sinh học và giúp cho chương trình Quốc gia phòng chống sốt rét đạt hiệu quả cao, giảm tỉ lệ mắc và chết do sốt rét, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm các mục tiêu:
1-    Xác    định thành phần loài KSTSR tại tỉnh Quảng Bình.
2-    Xác định cơ cấu và tỉ lệ nhiễm phối hợp KSTSR tại tỉnh Quảng Bình.
3.    Xác định tính đa hình di truyền của p. falciparun.
MỤC LỤC
Trang
Các chữ viết tắt    3
Tóm tắt    4
Đặt vấn đề    5
Chương I    7
“‘1 Ẩ< –
TỐNG QUAN TÀI LIỆU    7
Đại cương về bệnh sốt rét    7
1.1.    Đặc điểm chung về bệnh sốt rét    7
1.2.    Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét    7
a.    Chu kỳ phát triển thể vô tính    7
b.    Chu kỳ phát triển thể hữu tính    8
2.    Tinh    hình sốt rét trên thế giới và ở việt nam    í 1
2.1    Tinh hình sốt rét trên thế giới.    11
2.2.    ‘Tình hình sốt rét ở Việt nam    12
3.    Các phương pháp chẩn đoán KSTSR và phân tích kiểu gen    13
3.1    Phương pháp phát hiện KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm giêm sa    1.3
3.2    Kỹ thuật QBC (Quantitative Buffy Coat).    14
3 .3 Các kỹ thuật miễn dịch    14
3.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử    1.5
4.    những nghiêm cứu nước Egoàỉ và trong nước    18
4.1.    Một số nghiên cứu trên thế giới.    18
4.2    Một số nghiên cứu ở Việt Nam    19
CHUƠNGIĨ    21
PHÒNG THÍ NGHIỆM VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 21
1.    Phòng thí nghiệm sinh học phân tử    21
2.    Hoá chất    21
3« Dụng cụ và trang bị:    2,3
4.    Địa điểm nghiên cứu;    24
4.1.    Nghiên    cứu ở thực địa:    24
4.2.    Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm:    24
4.3.    Đối tượng nghiên cứu:    24
4.4.    Thời gian nghiên cứu: 2004 – 2005    24
5.    Phương pháp nghiên cứu    24
5.1.    Phương pháp thu thập mẫu:    2,4
5.2.    Phương pháp tách, tinh khiết ADN:    25 5.3. Phản ứng PCR:
5.4 Phân tích kết quả:
5.5.    Đánh giá kết quả:
5.6.    Xử lý số liệu:
CHUƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
A.    Kết qủa
1.    Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài KSTSR
1.1.    Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài KSTSR bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giêm sa.
1.2.    Kết quả xác định thành phần, cơ cấu loài KSTSR bằng kỹ thuật PCR.
2.    Kết quả về tính đa hình di truyền của p. falciparum tại Quảng Bình.38
2.1.    Kết quả phân tích kiểu gen trên locus MSP1.
2.2.    Kết quả phân tích kiểu gen trên locus MSP2.
2.3.    Kết quả phân tích kiểu gen trên locus GLURP.
3.    So sánh đa hình di truyền của 2 quần thể p.falciparum
3.1.    So sánh tính đa hình trên locus MSP1:
3.2.    So sánh tính đa hình trên locus MSP2:
3.3.    So sánh kiểu gen của quần thể p.falciparum của huyện Lệ Thuỷ giữa 2 năm 2004 và 2005
B.    thảo luận
1.    Thành phần loài và cơ cấu KSTSR tại Quảng Bình
2.    Tính đa hình đi truyền của p. falciparum tại Quảng Bình
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ
A.    KẾT LUẬN
B.    KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1.    Trình độ công nghệ của kết quả
2.    Khả năng ứng dụng
3.    Kết quả đào tạo của đề tài