Áp dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại bệnh viện nhi trung ương

Tại bệnh viện Nhi TW trong 8 năm (1997 – 2004) có 3055 bệnh nhân mắc bệnh di truyền, chiếm 1,6% tổng số bệnh nhân toàn viện [2]. Trong đó bất thường nhiễm sắc thể (NST) chiếm khoảng  30% [1]. Bất  thường  của  bộ  NST bao gồm các bất thường về cấu trúc và số lượng. Trong đó, bất thường về cấu trúc NST là những bất thường rất đa dạng, bao gồm mất đoạn, chuyển đoạn, thêm đoạn. Đặc biệt, với những mất đoạn nhỏ, hoặc mất đoạn và chuyển đoạn phức tạp, việc đánh giá các bất thường này ở mức độ karyotype là tương đối hạn chế. Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử, sử dụng những đầu dò đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang cho từng vùng  NST nghi ngờ  có  bất thường  cấu  trúc, và các tín hiệu này được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang. Có hai dạng FISH là Interphase FISH và Metaphase FISH.
–    Iterphase FISH: được sử  dụng để  phát hiện nhanh các bất thường NST không qua nuôi cấy. Cặp mồi được gắn trực tiếp vào nhân tế bào ở kỳ đầu của quá trình phân bào, do đó interphase FISH không cho phép quan sát hình dạng của NST, và thường được sử dụng để phát hiện các bất thường số lượng NST ở tế bào bào thai trong chẩn đoán trước sinh do ưu thế về thời gian, sau 24 – 48h.
–    Metaphase FISH: Cặp mồi được gắn vào các NST ở kỳ giữa, khi hình thái các NST được nhận biết rõ ràng nhất. Metaphase FISH thường đựoc dùng để khẳng định các bất thường về số lượng và cấu trúc NST khi nghi ngờ có bất thường NST trên công thức nhiễm sắc thể. Trong nghiên cứu này,  chúng  tôi  sử  dụng  Metaphase  FISH  cho những  bệnh  nhân  đã  có  nghi ngờ  bất  thường NST trên karyotype.
Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu:
Áp dụng kỹ FISH nhằm phát hiện nghi ngờ bất thường cấu trúc nhiễm sẵc trên công thức nhiễm sắc thể.
II.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG  PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng và bệnh phẩm
3 bệnh nhân có chỉ định làm công thức NST từ  tế  bào  máu  ngoại  vi. Tế  bào  máu  ngoại  vi được  nuôi  cấy  trong môi  trường  RPMI (Gibco) với sự có mặt của PHA (Sigma) nhằm kích thích sự phát triển của tế bào lympho T. Sau 72h nuôi cấy, tế bào sẽ được thu hoạch, tạo tiêu bản. NST được nhuộm băng bằng Giemsa (Merk) và được phân tích dưới kính hiển vi.
Phân tích NST của 3 bệnh nhân này chúng tôi nghi ngờ có bất thường cấu trúc NST. Chúng tôi tiến hành kỹ thuật FISH nhằm xác định bất thường này. Cặn tế bào thu hoạch được sau khi nuôi cấy NST được sử dụng để làm metaphase FISH.
2.    Kỹ thuật FISH
Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật được sử dụng để xác định sự có mặt của một NST hoặc một vùng  NST nào  đó  thông  qua việc  gắn  một cặp mồi DNA đã  được đánh dấu  huỳnh quang vào NST hoặc vùng NST cần được xác định.
–    Tạo tiêu bản: cặn tế bào đã qua nuôi cấy được  phun trên  lam kính sạch  (BDH),  để  khô trên  hotplate  (Thermo)  560C.  Tiêu  bản  được kiểm tra trên kính hiển vi soi ngược (Leica) để đánh  giá  mật  độ  tế  bào  trên  vùng  tiêu  bản  sẽ được tiếp xúc vơí đầu dò đặc hiệu. Số lượng yêu cầu khoảng 10 – 15 tế bào/vi trường, hoặc 1 – 2 cụm nhiễm sắc thể/vi trường.
–    Lai đầu dò đặc hiệu: chúng tôi sử dụng 03 loại đầu dò khác nhau trong nghiên cứu tuỳ vào từng trường hợp.
Đầu dò RP11 – 540E20 (Italian) đánh dấu ở nhánh  ngắn  NST  X  đoạn  Xp21.2  và  đầu  dò RP11 – 114E9 (Italian) đánh dấu ở nhánh dài NST X đoạn Xq21 trong bất thường NST X.
Đầu dò SNRPN đánh dấu ở nhánh dài NST
15 đoạn 15q11 và đầu dò PML đánh dấu ở nhánh dài NST 15 đoạn 15q24 (Kreatech) trong HC Prader Willi.
Đầu  dò  TUPLE đánh  dấu  ở  nhánh  dài  NST 22 đoạn 22q11 và đầu dò ST đánh dấu ở tận cùng NST 22 đoạn 22qter trong HC Trisomy 22.
Nhỏ 10µl đầu dò vào mỗi vùng tiêu bản tương ứng được đánh dấu, đậy lamme kích thước 18x18mm (BDH) lên trên vùng tiêu bản vừa tiếp xúc với đầu dò. Tiêu bản được biến tính ở 750C trong 5 phút, và được giữ ở 370C qua đêm.
–    Rửa tiêu bản: Tiêu bản sau khi được lai với probe đặc hiệu, được rửa qua dung dich SSC2X (Sigma) và SSC2X/0.3%NP40 (MP) ở 760C. Vùng lai  probe  được  phủ  bằng  DAPI  (Sigma),  cuối cùng được phủ bằng lamme 22 x 22mm (BDH).
–    Phân tích dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang  với  phần  mềm  ISIS  (Metasystem).  Tiêu chuẩn phát hiện dựa vào các tín hiệu của đầu dò:
Với đầu dò RP11 – 540E20, thể hiện 1 cặp tín hiệu đỏ ở nhánh dài và 1 cặp tín hiệu đỏ ở nhánh ngắn NST X. Nếu không có bất thường NST, sẽ thể hiện 2 cặp tín hiệu đỏ. Nếu có mất đoạn nhánh ngắn NST X, chỉ thể hiện 1 cặp tín hiệu của nhánh dài NST X.
Với đầu dò SNRPN/PML cho NST 15, trong trường  hợp  không  có  bất  thường  NST, sẽ  thể hiện 2 tín hiệu xanh là tín hiệu kiểm chứng cho NST 15 vùng 15q24, và 2 tín hiệu đỏ của vùng 15q11.2. Trong trường hợp của hội chứng PraderWilli, sẽ thể hiện 2 tín hiệu xanh và chỉ có 1 tín hiệu đỏ do mất đoạn vùng 15q11.2.
Với đầu dò TUPLE cho NST 22, sẽ có 2 cặp tín hiệu  xanh là  tín hiệu  kiểm  chứng  cho NST 22 vùng 22qter, và 2 cặp tín hiệu đỏ là tín hiệu của vùng 22q11. Trong trường hợp không có bất thường NST 22, sẽ thể hiện 2 cặp tín hiệu xanh và 2 cặp tín hiệu đỏ. Nếu có bất thường số lượng
NST 22 (Trisomy 22), sẽ  thể  hiện  03 cặp  tín hiệu đỏ. Kết hợp nếu có  bất thường cấu trúc ở nhánh  dài  NST 22 (Mất  đoạn  tận  cùng  nhánh dài NST 22), sẽ thể hiện 2 tín hiệu xanh.
Bất  thường  nhiễm  sắc  thể  (NST) chiếm  một  vị trí quan trọng  trong nguyên  nhân  của  các  bệnh  di truyền 30% (1). Bất thường NST bao gồm hai dạng chính là bất thường về cấu trúc và số lượng. Mục tiêu: áp dụng kỹ thuật FISH phát hiện bất thường cấu trúc NST trên 3 trường hợp nghi ngờ có bất thường cấu trúc NST trên công thức NST. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 03 bệnh nhân nghi ngờ có bất thường cấu trúc NST trên công thức NST, được áp dụng kỹ thuật FISH để xác định bất thường cấu trúc NST. Kết quả: phát hiện 1 ca mất đoạn 15q11 – q13 trong hội chứng (HC) PraderWilli, 1 ca mất đoạn Xq11 – pter trong HC Turner, 1 ca mất đoạn 22qter trong HC Trisomy 22. Kết luận: áp dụng kỹ thuật FISH để xác định 3 trường hợp nghi ngờ có bất thường cấu trúc NST trên công thức nhiễm sắc thể.