Áp dụng kỹ thuật QF- PCR để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down

Dị tật bẩm sinh đã và đang là một vấn đề quan trọng ngày càng thu hút sự quan tâm chú ý của toàn xã hội nói chung và ngành y tế nói riêng. Dị tật bẩm sinh không chỉ để lại những hậu quả nặng nề, những thiệt thòi lớn cho trẻ mà còn để lại những gánh nặng lớn, những ảnh hưởng tâm lý sâu sắc của người mẹ trong những lần mang thai tiếp theo.

Hội chứng Down (DS) là một bệnh lý có tần suất cao nhất trong các bệnh rối loạn NST. Theo Who (1972) tần số DS là 120 – 150/100000 trẻ sơ sinh đẻ sống, có những biểu hiện đặc trưng về hình thái và chậm phát triển về trí tuệ.

Tỷ lệ tử vong của DS cao, khoảng 20% trẻ DS sinh ra chết trước 5 tuổi. 44% số trẻ DS còn lại có thể sống tới tuổi 60, nhưng không có khả năng học tập và làm việc [13], [33]. Cho đến nay chưa có biện pháp điều trị nào đối với bệnh di truyền nói chung và DS nói riêng, chính vì vậy việc phòng và hạn chế bệnh di truyền là việc cấp thiết để giảm bớt những bệnh tật di truyền, giảm bớt gánh nặng về kinh tế cũng như tâm lý cho gia đình và xã hội.

Việc chẩn đoán phát hiện sớm các bệnh di truyền ở thời kỳ phôi thai là vô cùng cấp thiết để có các biện pháp phòng và xử lý kịp thời. Hiện nay có nhiều kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán trước sinh DS như: siêu âm, dùng bộ ba sàng lọc triple test (AFP, PHCG, uE3), FISH, nuôi cấy tế bào ối… Đối với những phụ nữ có nguy cơ cao mắc DS trong thời kỳ mang thai được đề nghị chọc ối để xét nghiệm di truyền tế bào thai theo phương pháp kinh điển đòi hỏi một thời gian dài (14 – 18 ngày), với một thể tích mẫu ối lớn (10 – 15 ml) mặt khác không phải khi nào cũng được các cặp vợ chồng đồng ý nên việc chẩn đoán cũng gặp nhiều khó khăn. Vấn đề đặt ra trong chẩn đoán trước sinh là thời gian thực hiện kỹ thuật làm sao để có câu trả lời sớm nhất cho những bà mẹ mang thai biết được tình trạng của mình. Gần đây người ta đã phát hiện ra các trình tự lặp lại ngắn STR (Short tandem repeat) có tính đa hình cao ở một số locus gen nhất định trên NST số 21. Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen PCR những locus này, chúng ta có thể xác định được số lượng các alen trên hình ảnh điện di. Do bất thường số lượng alen tương ứng với bất thường NST nên phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường NST một cách nhanh chóng và chính xác mà không phải qua nuôi cấy tế bào. Kỹ thuật QF – PCR gọi là phản ứng chuỗi polymer hóa huỳnh quang định lượng dùng để khuếch đại các STR. Đây là phương pháp xác định dị tật về gen và NST hiệu quả và nhanh chóng hơn các phương pháp khác. Với ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật trước đây, kỹ thuật QF – PCR có độ đặc hiệu cao, thời gian trả kết quả nhanh (1 – 2 ngày), với thể tích mẫu ối nhỏ (0,5 – 1 ml) và giá thành thấp hơn so với kỹ thuật FISH, hơn nữa nhân lực sử dụng và khả năng áp dụng với quy mô lớn, đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán cao. Kỹ thuật này đã được ứng dụng phổ biến trên thế giới, ở Việt Nam kỹ thuật QF – PCR vẫn còn là mới vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Áp dụng kỹ thuật QF- PCR để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down ” với hai mục tiêu:

1. Phát hiện thai hội chứng Down bằng kỹ thuật QF – PCR.

2. Đánh giá giá trị của kỹ thuật QF – PCR trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1. Lược sử nghiên cứu về hội chứng Down 3

1.2. Tần suất của hội chứng Down 3

1.3. Nguyên nhân gây nên hội chứng Down 4

1.3.1. Do tuổi của bố mẹ cao 4

1.3.2. Do di truyền từ bố hoặc mẹ có biểu hiện rối loạn NST 4

1.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường 5

1.4. Các bất thường NST gây nên hội chứng Down 5

1.5. Nghiên cứu kiểu hình của hội chứng Down 6

1.6. Xét nghiệm sàng lọc trước sinh hội chứng Down 7

1.6.1. Sàng lọc theo tuổi mẹ 7

1.6.2. Sàng lọc bằng siêu âm thai 9

1.6.3. Sàng lọc bằng định lượng một số sản phẩm của thai có trong huyết

thanh mẹ 10

1.7. Các phương pháp lấy mẫu dùng trong chẩn đoán trước sinh thai Down. ..14

1.7.1. Phương pháp lấy tế bào trực tiếp 14

1.7.2. Phương pháp lấy tế bào thai gián tiếp từ máu mẹ 17

1.8. Kỹ thuật di truyền được áp dụng để chẩn đoán trước sinh thai bị Down ..18

1.8.1. Chẩn đoán bằng phương pháp di truyền tế bào 18

1.8.2. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào – Phân tử

bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH) 18

1.8.3. Chẩn đoán bằng phương pháp di truyền phân tử – Kỹ thuật QF- PCR… 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1. Đối tượng nghiên cứu 25

2.2. Địa điểm lấy mẫu và địa điểm phân tích mẫu 25

2.2.1. Địa điểm lấy mẫu 25

2.2.2. Địa điểm phân tích mẫu 25

2.3. Thời gian 25

2.4. Phương tiện nghiên cứu 25

2.4.1. Dụng cụ 25

2.4.2. Hóa chất 26

2.5. Phương pháp nghiên cứu 26

2.5.1. Thiết kế nghiên cứu 26

2.5.2. Cỡ mẫu 26

2.6. Kỹ thuật sử dụng 26

2.6.1. Tách chiết ADN 28

2.6.2. Phương pháp định lượng ADN 29

2.6.3. Khuếch đại trình tự STR bằng kỹ thuật QF – PCR 30

2.6.4. Điện di trên máy ABI 3130 XL 33

2.6.5. Phân tích kết quả 35

2.7. Xử lý và phân tích số liệu 35

2.8. Đạo đức trong nghiên cứu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1. Một số đặc điểm sinh học của nhóm đối tượng nghiên cứu 36

3.1.1. Đặc điểm của thai phụ 36

3.1.2. Kết quả sàng lọc trước sinh của thai phụ 37

3.2. Kết quả QF – PCR 38

3.2.1. Một số khâu chính trong quy trình kỹ thuật QF – PCR 38

3.2.2. Kết quả tách chiết và đo độ tinh sạch của ADN 39

3.2.3. Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF – PCR 40

3.3. Đánh giá giá trị của kỹ thuật QF – PCR 41

3.3.1. Mức độ phát hiện các alen của NST 21 44

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53

4.1. Đặc điểm sinh học của nhóm đối tượng nghiên cứu 54

4.1.1. Đặc điểm của người mẹ mang thai 54

4.1.2. Kết quả sàng lọc trước sinh của người mẹ mang thai 55

4.2. Kết quả kỹ thuật QF – PCR 57

4.2.1. Quy trình kỹ thuật QF – PCR 57

4.2.2. Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF – PCR 62

4.2.3. Độ chính xác phân bố theo tỷ lệ alen của NST 21 63

4.3. Độ chính xác của kỹ thuật QF – PCR so với kỹ thuật di truyền tế bào65

KẾT LUẬN 72

KIẾN NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC