Áp dụng quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplification
Loạn dưỡng cơ Duchenne là một trong những bệnh lý về cơ do di truyền thường gặp nhất có tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Bệnh gây nên do đột biến gen dystrophin nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể X [7]. Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen di truyền từ người mẹ mang gen (người mẹ dị hợp tử), 1/3 bệnh nhân là do đột biến mới phát sinh. Hiện nay, khi chưa tìm được phương pháp điều trị bệnh hiệu quả thì những nỗ lực nghiên cứu nhằm phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ và chị, em gái) trong gia đình bệnh nhân, chẩn đoán trước sinh trên những bà mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di truyền vẫn là biện pháp cơ bản để phòng ngừa bệnh DMD [6].
Nhiều kỹ thuật và phương pháp chẩn đoán sớm căn bệnh này đã được nghiên cứu đưa vào ứng dụng. Các phương pháp chẩn đoán dựa trên lâm sàng (kể cả những xét nghiệm hóa sinh và sinh thiết cơ) thường đem lại chẩn đoán chính xác nhưng lại muộn, khiến cho sự can thiệp của người thầy thuốc hết sức hạn chế. Các kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử phát triển mạnh trong những năm gần đây đã đem lại lợi ích đáng kể cho gia đình bệnh nhân. Có nhiều hướng tiếp cận khác nhau từ đơn giản đến phức tạp nhằm xác định vị trí gen đột biến: xác định tổn thương gen ở mức độ DNA, mRNA bằng các kỹ thuật PCR đơn mồi, đa mồi, kỹ thuật lai hóa, hay giải trình tự gen. Tất cả các kỹ thuật này xác định chính xác vị trí gen bị tổn thương giúp xây dựng cây phả hệ di truyền gen này trong gia đình bệnh nhân đã tạo điều kiện cho việc chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền. Một kỹ thuật được cho là tối ưu phải đáp ứng đầy đủ các yếu tố: chính xác, nhanh và giá thành hợp lý. Chính vì vậy, nhiều kỹ thuật mới đã và đang được nghiên cứu ứng dụng. Mục tiêu: Áp dụng quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh DMD ở Việt Nam bằng kỹ thuật MLPA.
I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
– Nhóm chứng: gồm 5 người nam và 5 người nữ bình thường, không có tiền sử gia đình mắc bệnh di truyền.
– Nhóm nghiên cứu: 03 thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh DMD.
2. Phương pháp nghiên cứu
Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số: Các mẫu DNA được tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp phenol/chloroform.
Kỹ thuật multiplex PCR định lượng xác định người mẹ mang gen (thể dị hợp tử): Áp dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng được hoàn thiện bởi nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội [1].
Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD
Chọc hút dịch ối: Chọc hút dịch ối được tiến hành vào tuần thứ 16 của thai kỳ dưới sự hướng dẫn của siêu âm.
Tách DNA của tế bào ối: DNA của tế bào ối được tách chiết theo phương pháp phenol – chloroform.
Xác định giới tính của thai nhi: sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen SRY (có kích thước 254 bp) đặc hiệu trên nhiễm sắc thể Y. Sự hiện diện của gen SRY chứng tỏ thai nhi là nam và ngược lại.
Kỹ thuật STR (Short Tandem Repeat) phát hiện khả năng nhiễm DNA của mẹ vào mẫu DNA thai nhi: Trong quá trình lấy mẫu ối việc lẫn máu của mẹ hoàn toàn có thể xảy ra làm cho kết quả không chính xác do khuếch đại cả DNA của máu mẹ. STR là đoạn trình tự lặp lại ngắn với số lần lặp lại tùy thuộc vào mỗi cá thể và mỗi vùng khác nhau trên nhiễm sắc thể, số lần lặp lại sẽ di truyền cho thế hệ sau tùy thuộc vào nhiễm sắc thể được nhận. Cặp mồi đánh dấu huỳnh quang đã được sử dụng để khuếch đại một số vùng gen STR đặc hiệu cho gen dytrophin trên mẫu ối và mẫu DNA thai phụ. Mỗi vùng STR sẽ tương ứng với một đỉnh sau điện di trên hệ thống mao quản.
Kỹ thuật MLPA xác định đột biến gen dystrophin của thai nhi: MLPA được tiến hành dựa vào vị trí đột biến xoá đoạn gen dystrophin của anh trai thai nhi. So sánh kết quả MLPA thai nhi với mẫu chứng và mẫu anh trai thai nhi. Quy trình MLPA được thực hiện như đã mô tả trước đây [4, 5].
Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy viết tắt là DMD) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X. Phát hiện người mẹ mang gen bệnh, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh sẽ giúp làm giảm tỷ lệ bệnh nhân DMD trong cộng đồng. Mục tiêu: Áp dụng quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh DMD bằng kỹ thuật Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification (MLPA). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 03 thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh DMD; Kỹ thuật tách chiết DNA từ tế bào ối và máu ngoại vi; Phương pháp Multiplex PCR định lượng, MLPA và Short Tandem Repeat (STR). Kết quả: Trong 3 thai phụ, 1 thai phụ được phát hiện là người mang gen bệnh nên có chỉ định chọc ối; 2 thai phụ không phải là người mang gen nên không có chỉ định chọc ối và được tư vấn giữ thai. Kết quả chẩn đoán trước sinh cho thấy thai nhi là nam, không mang gen đột biến và thai phụ này cũng được tư vấn giữ thai. Kết luận: Đã áp dụng thành công quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh DMD bằng kỹ thuật MLPA.
Thông tin này hy vọng sẽ gợi mở cho các bạn hướng tìm kiếm và nghiên cứu hữu ích