bệnh morquio a: tương quan giữa kiểu gen,kiểu hình và marker sinh học

Mucopolysaccharidosis IVA (MPS IVA, bệnh Morquio A; OMIM# 253000) là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoạt độ của enzim N – acetylgalactosamin 6 – sul- fate sulfatase (GALNS) của thể tiêu bào (lysosome). Thiếu hụt hoạt độ của enzim GALNS gây nên tích tụ glycosaminoglycan (GAGs), keratan sulfate (KS) và chondroitin 6 – sulfate (C6S) tại thể tiêu bào ở khắp các cơ quan của cơ thể, đặc biệt là các tế bào sụn, giác mạc mắt [7]. Triệu chứng đặc trưng của bệnh là loạn sản hệ xương bao gồm: lùn, cong vẹo cột sống, xẹp các đốt sống, cứng khớp gối, biến dạng lồng ngực, dây chằng lỏng lẻo, đục giác mạc, gan to, bộ mặt thô, giảm thính lực và bệnh lý của van tim. MPS IVA khác với các thể bệnh mucopoly- saccharidosis khác là phát triển tinh thần bình thường. Mức độ nặng nhẹ về lâm sàng rất khác nhau trong bệnh MPS IVA, các bệnh nhân mắc thể nặng thường tử vong trong khoảng từ 20 – 30 tuổi, trong khi thể nhẹ hơn có thể sống đến 60 – 70 tuổi. Mức độ chậm phát triển chiều cao và chiều cao cuối cùng của trẻ mắc MPS IVA phản ánh mức độ nặng của bệnh [1, 2].
Gen GALNS nằm trên nhiễm sắc thể 16 (16q24.3), bao gồm 14 exon với kích thước 50 kb, mã hóa cho phân tử cDNA bao gồm 1566bp, sản phẩm của gen là enzim GALNS bao gồm 522 axit amin. Tính đến nay, kết quả phân tích phân tử trên các bệnh nhân của các cộng đồng khác nhau trên thế giới đã báo cáo hơn 172 các đột biến khác nhau bao gồm cả 19 đột biến mới trong báo cáo này của gen GALNS. Sự đa dạng hóa của các đột biến khác nhau của gen GALNS phù hợp với sự đa dạng về mức độ nặng nhẹ của bệnh trên lâm sàng. Đa số các đột biến của gen GALNS là các đột biến điểm missense và đột biến mất đoạn nhỏ của gen [3].
GAGs là thành phần oligosaccharide của proteoglycan (các phân tử lớn tham gia vào cấu trúc và đảm bảo chức năng của mô liên kết). Dermatan sulfate, heparan sulfate, KS và chondroitine sulfate là các thành phần chính của GAGs tại các mô. Trong bệnh MPS IVA, sự giáng hóa  của  KS  bị  thiếu  hụt  do  tổn  thương  gen GALNS. KS chủ yếu có mặt tại các sụn, giác mạc, và đây cũng chính là các cơ quan bị tổn thương chính trong bệnh MPS IVA. Cơ chế đặc hiệu của việc tích tụ KS gây loạn sản hệ thống xương chưa được hoàn toàn sáng tỏ [6, 9, 10].
Mối tương quan giữa kiểu gen, kiểu hình (biểu hiện lâm sàng) đã được sử dụng để dự báo mức độ nặng nhẹ của bệnh trên một số bệnh nhân mắc MPS IVA. Nồng độ KS trong máu và nước tiểu của bệnh nhân mắc MPS IVA, cùng với kiểu  gen  của  bệnh  nhân,  được  gợi  ý  như  là macker sinh học có giá trị để đánh giá mức độ nặng của bệnh. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây về mối tương quan giữa kiểu gen, kiểu hình và KS ở bệnh nhân MPS IVA chỉ được tiến hành trên các cộng đồng bệnh nhân đặc biệt với số lượng nhỏ bệnh nhân [4, 5, 7]. Bệnh MPS IVA là một bệnh hiếm, để giúp cho việc chẩn đoán sớm chính xác, giúp điều trị tốt hơn thì việc hiểu rõ mối tương quan giữa kiểu gen, kiểu hình và các marker sinh học trong đó có KS trên số lượng lớn bệnh nhân mắc MPS IVA là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, với một số lượng tương đối lớn các bệnh nhân mắc MPS IVA của các cộng đồng khác nhau trên thế giới, chúng tôi giả thiết là các bệnh nhân mắc thể nặng của bệnh sẽ có các đột biến của gen GALNS mà gây tổn thương cấu trúc bốn chiều, vị trí hoạt động của men GALNS và sẽ có mức độ tăng cao của KS trong máu và nước tiểu. Bệnh nhân mắc thể nhẹ hơn sẽ có các đột biến mà ít ảnh hưởng đến cấu trúc bốn chiều và không gây tổn thương vị trí hoạt động của enzim GALNS, và sẽ có mức độ tăng KS trong máu và nước tiểu nhẹ hơn. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu:
1.    Phát hiện và xác định đặc điểm của  các đột biến mới của gen GALNS.
2.    Tìm hiểu mối tương quan giữa kiểu  gen, kiểu hình và marker sinh học KS ở  các  bệnh nhân MPS IVA.
II.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề cương nghiên cứu được phê chuẩn bởi IRB (Institutional Review Board) thuộc trường Đại Học tổng hợp St. Louis. MO. Hoa Kỳ.
1.    Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu bao gồm 50 bệnh nhân mắc MPS IVA (nam 27, nữ 23; tuổi từ 7 tháng đến 18 tuổi) chưa từng được báo cáo trong y văn trên thế giới và trong nước. Chẩn đoán xác định bằng đo hoạt độ enzim GALNS từ bạch cầu lympho máu ngoại vi hoặc fibroblast của da (thấp hơn 5% so với người bình thường).
2.    Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại viện nghiên cứu Nhi Khoa, Khoa Nhi, trung tâm Y học, Đại học Y, Đại học tổng hợp St. Louis, MO, Hoa Kỳ.
    Đánh giá mức độ nặng của biểu hiện lâm sàng: các bệnh nhân đều có mẫu bệnh án nghiên cứu, trong đó bao gồm việc khai  thác, đánh giá các triệu chứng kinh điển của bệnh, tiền sử phẫu thuật chỉnh hình hệ xương khớp, đánh giá sự tăng trưởng chiều cao và so sánh với biểu đồ chiều cao trong bệnh MPS IVA đã được công bố trên y văn [2]. Các bệnh nhân mắc thể nặng khi có biểu đồ tăng trưởng chiều cao nằm dưới 50 bách phân vị của biểu đồ tăng trưởng chiều cao trong  bệnh MPS IVA. Bệnh nhân mắc thể nhẹ  hơn khi có biểu đồ tăng trưởng chiều cao nằm trùng với hoặc nằm  trên  50  bách  phân  vị  của  biểu  đồ  tăng trưởng chiều cao trong bệnh MPS IVA.
    Phân tích đột biến của gen GALNS: DNAs của các bệnh nhân mắc MPS IVA được chiết tách từ  bạch  cầu  lympho  máu   ngoại   vi  hoặc  từ fibroblast da nuôi cấy. Để phân tích đột biến của gen GALNS, kỹ thuật  long – PCR được thay thế cho kỹ thuật PCR cổ điển, chúng tôi thiết kế 5 bộ primer bao gồm toàn bộ 14 exon và quanh vùng gắn  nối của exon – intron của gen GALNS. Sản phẩm  PCR  được  tinh  sạch  và  đựợc phân  tích sequencing trực tiếp bằng các primer đặc hiệu
Bệnh Morquio A hay Mucopolysaccharidosis IVA (MPS IVA) là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, bệnh gây nên do thiếu hụt enzyme N – acetylgalactosamine – 6 – sulfate sulfatase (GALNS) dẫn đến loạn dưỡng xương do sự tích tụ quá mức chất chuyển hóa keratan sulfate (KS). Để có thể tiên lượng chính xác và điều trị bệnh một cách thích hợp thì việc hiểu biết mối tương quan giữa kiểu gen, kiểu hình và KS là thiết yếu. Mục tiêu: phát hiện và xác định đặc điểm các đột biến mới của gen GALNS, tìm hiểu mối tương quan giữa kiểu gen, kiểu hình và nồng độ KS trong máu và nước tiểu của bệnh nhân mắc MPS IVA. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 50 bệnh nhân được chẩn đoán mắc MPS IVA và chưa từng được báo cáo trong y văn. Phát hiện và phân tích đột biến của gen GALNS bằng kỹ thuật PCR sau đó phân tích trực tiếp trình tự gen. Sử dụng kỹ thuật “high sensitive ELISA” để đo nồng độ KS trong máu và nước tiểu. Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen, kiểu hình và KS ở các bệnh nhân có đầy đủ các thông tin. Kết quả: 48 đột biến khác nhau bao gồm 19 đột biến mới (9 missense, 1 nonsense, 2 mất đoạn nhỏ, 1 thêm đoạn, và 6 splice – site) đã được xác định chiếm 88% các alleles đột biến. 32 đột biến kết hợp với thể nặng của bệnh và 15 đột biến kết hợp với thể nhẹ hơn của bệnh. Nồng độ KS trong máu và nước tiểu của các bệnh nhân MPS IVA cao hơn nhóm chứng bình thường, nồng độ KS trong máu của các bệnh nhân MPS IVA thể nặng cao gấp 1,4 lần so với thể nhẹ, nồng độ KS nước tiểu của các bệnh nhân MPS IVA thể nặng cao gấp 4,6 lần thể nhẹ. Tỷ lệ KS/GAG toàn phần của các bệnh nhân thể nhẹ là 2,2%, thể nặng là 3,9%, trong khi ở trẻ bình thường là 0,5%. Kết luận: nghiên cứu này cung cấp bằng chứng về sự đa dạng của đột biến gen GALNS. Kết hợp việc phân tích đột biến gen với đánh giá lâm sàng và nồng độ KS sẽ giúp dự đoán mức độ nặng của bệnh chính xác hơn, và sẽ được sử dụng để đánh giá kết quả điều trị bằng liệu pháp thay thế enzyme và gen trị liệu trong tương lai.