Biểu hiện, tinh sạch protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố không chịu nhiệt LT của E.coli

E.coli sinh độc tố ruột (ETEC) là một căn nguyên gây tiêu chảy thường gặp ở trổ em tại các nước đang phát triển. Tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt (LTB) đã và đang được nghiên cứu để làm vắc xin, tá chất trong vắc xin uống để kích thích miễn dịch cũng như sử dụng để phát triển các bộ kit để phát hiện độc tố LT. Mục tiêu: (1) Biểu hiện protein tái tổ hợp LTB trong E.coli, (2) Tinh sạch protein tái tổ hợp LTB. Phương pháp: sử dụng vector pGEX – GST – LTB để biểu hiện protein tái tổ hợp LTB trong tế bào E.coli BL21. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột glutathione – sepharose và kiểm tra độ tinh sạch của protein tái tổ hợp bằng điện di SDS – polyacrylamid và v/estern bloting. Kết quả: (1)Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp LTB, (2>Protein tái tổ hợp được tinh sạch ở mức độ cao.

Ngộ độc thực phẩm hiện nay là một trong những mối nguy cơ chính tác động đến sức khỏe con người. Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là vius, vi khuẩn, ký sinh trùng. Vi khuẩn E.coli là một trong những căn nguyên chính gây ngộ độc thực phẩm và tiêu chảy, đặc biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [2]. Hàng năm trên thế giới có khoảng 210 triệu người bị ngộ độc thực phẩm do E.coli và 380.000 trường hợp tử vong [2, 3].
E.coli sinh độc tố ruột ETEC, gồm 2 loại: độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) và độc tố chịu nhiệt ST (heatstabletoxin). Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu và sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT (LTB) của ETEC và sử dụng protein tái tổ hợp này để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây ngộ độc thực phẩm bằng kỹ thuật ELISA và phản ứng ngưng kết hạt. Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổ hợp LTB gây miễn dịch tạo ra kháng thể kháng LTB, sau đó sử dụng kháng thể này để phát hiện LTB trong thực phẩm. Nhằm tạo protein tái tổ hợp các nhà khoa học sử dụng vector pGEX để thiết vector biểu hiện mang đoạn gen LTB dưới sự điều khiển của promoter Tac. Đoạn gen LTB được cắt từ sản phẩm PCR bằng enzym BamHI và Xhol, sau đó được biến nạp vào vector pGEX đã được mở vòng để sử dụng biểu hiện protein tái tổ hợp. Việc nhập ngoại các bộ Kit sinh học chẩn đoán LTB trong thực phẩm có giá thành cao, chưa thích hợp để sử dụng trong điều kiện kinh tế nước ta hiện nay. Tiếp theo sự thành công trong thiết kế vector biểu hiện protein tái tổ hợp LTB, đề tài nghiên cứu: “Biểu hiện, tinh sạch protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố không chịu nhiệt LT của E.coli” được thực hiện nhằm mục tiêu: (1) Biểu hiện protein tái tổ hợp LTB trong E.coli, (2) Tinh sạch protein tái tổ hợp LTB.
II.    NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.    Nguyên liệu
–    Chủng chuẩn E.coli BL21.
–    Vector pGEX – GST – LTB (Tạ Thành Văn và cộng sự).
–    Cột glutathione – sepharose gel (Pharamacia).
–    Kháng thể đặc hiệu kháng LTB (Sigma).
2.    Phương pháp
2.1.    Biểu hiện protein tái tổ hợp LTB
Vector pGEX – GST – LtB được biến nạp vào tế bào E.coli BL21.
Promoter Tac điều khiển sự biểu hiện của protein tái tổ hợp LTB bằng chất cảm ứng IPTG nồng độ 1 mM trong môi trường canh thang LB có Ampicillin.
2.2.    Tinh sạch protein tái tổ hợp LTB
1    2    3    4    5
–    Dịch tế bào chứa protein tái tổ hợp được đưa vào cột glutathione – sepharose gel (Pharamacia).
–    Các thành phần không phải protein tái tổ hợp được rửa qua cột bằng dung dịch đệm phosphate buffer salin (PBS).
–    Thu hoạch protein tái tổ hợp bằng Tris buffer.
–    Kiểm tra độ tinh sạch và định lượng protein tái tổ hợp:
+ Điện di protein tái tổ hợp trên gel SDS – polyacrylamide 12% (Pharmacia Phast System. 10
–    15% gradient gels) và nhuộm gel bằng Coomasie Blue R250.
+ Xác định nồng độ protein tái tổ hợp LTB bằng VVestern blot, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng LTB.