Biểu hiện, tinh sạch Protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt lt của E. coli

E.coli sinh độc tố ruột (ETEC) là một căn nguyên gây tiêu chảy thường gặp ở trẻ em tại các nước ñang phát triển. Tiểu đơn vị B ñộc tố không chịu nhiệt (LTB) đã và đang ñược nghiên cứu ñể làm vắc xin, tá chất trong vắc xin uống ñể kích thích miễn dịch cũng như sử dụng ñể phát triển các bộ kit ñể phát hiện ñộc tố LT. Mục tiêu: (1) Biểu hiện protein tái tổ hợp LTB trong E.coli, (2) Tinh sạch protein tái tổ hợp LTB. Phương pháp: sử dụng vector pGEX – GST – LTB ñể biểu hiện protein tái tổ hợp LTB trong tế bào E.coli BL21. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột glutathione – sepharose và kiểm tra ñộ tinh sạch của protein tái tổ hợp bằng ñiện di SDS – polyacrylamid và Western bloting. Kết quả: (1)Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp LTB, (2)Protein tái tổ hợp ñược tinh sạch ở mức độ cao.

Ngộ  độc  thực  phẩm  hiện  nay  là  một  trong những mối nguy cơ chính tác ñộng ñến sức khỏe con người. Tác nhân gây ngộ ñộc thực phẩm chủ yếu là vius, vi khuẩn, ký sinh trùng. Vi khuẩn E.coli là một trong những căn nguyên chính gây ngộ ñộc thực phẩm và tiêu chảy, ñặc biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [2]. Hàng năm trên thế giới có khoảng 210 triệu người bị ngộ ñộc thực phẩm do E.coli và 380.000 trường hợp tử vong [2, 3].
E.coli sinh ñộc tố ruột ETEC, gồm 2 loại: ñộc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) và ñộc tố chịu nhiệt ST (heat stable toxin). Trên thế giới, các nhà khoa học ñã nghiên cứu và sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu ñơn vị B của ñộc tố LT (LTB) của ETEC và sử dụng protein tái tổ hợp này ñể thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn ñoán ETEC gây ngộ ñộc thực phẩm bằng kỹ thuật ELISA và phản ứng ngưng kết hạt. Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổ hợp LTB gây miễn dịch tạo ra kháng thể kháng LTB, sau ñó sử dụng kháng thể này ñể phát hiện LTB trong thực phẩm. Nhằm tạo protein tái tổ hợp các nhà khoa học sử dụng vector pGEX ñể thiết vector biểu hiện mang ñoạn gen LTB dưới sự ñiều khiển của promoter Tac. Đoạn gen LTB ñược cắt từ sản phẩm PCR bằng enzym BamHI và XhoI, sau ñó ñược biến nạp vào vector pGEX đã được mở vòng để sử dụng biểu hiện protein tái tổ hợp. Việc nhập ngoại các bộ Kit sinh học chẩn ñoán LTB trong thực phẩm có giá thành cao, chưa thích hợp ñể sử dụng trong ñiều kiện kinh tế nước ta hiện nay. Tiếp theo sự thành công trong thiết kế vector biểu hiện protein tái tổ hợp LTB, ñề tài nghiên cứu: “Biểu hiện, tinh sạch protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố không chịu nhiệt LT của E.coli” ñược thực hiện nhằm mục tiêu: (1) Biểu hiện protein tái tổ hợp LTB trong E.coli, (2) Tinh sạch protein tái tổ hợp LTB.
II.    NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Nguyên liệu
–    Chủng chuẩn E.coli BL21.
–    Vector pGEX – GST – LTB (Tạ Thành Văn và cộng sự).
–    Cột glutathione – sepharose gel (Pharamacia).
–    Kháng thể ñặc hiệu kháng LTB (Sigma).
2.    Phương pháp
    Biểu hiện protein tái tổ hợp LTB
Vector pGEX – GST – LtB ñược biến nạp vào tế bào E.coli BL21. Promoter Tac ñiều khiển sự biểu hiện của protein tái tổ hợp LTB bằng chất cảm ứng IPTG nồng ñộ 1mM trong môi trường canh thang LB có Ampicillin.
    Tinh sạch protein tái tổ hợp LTB
–    Dịch tế bào chứa protein tái tổ hợp ñược ñưa vào cột glutathione – sepharose gel (Pharamacia).
–    Các thành phần không phải protein tái tổ hợp ñược rửa qua cột bằng dung dịch ñệm phosphate buffer salin (PBS).
–    Thu hoạch protein tái tổ hợp bằng Tris buffer.
–    Kiểm tra ñộ tinh sạch và ñịnh lượng protein tái tổ hợp:
+ Điện di protein tái tổ hợp trên gel SDS – polyacrylamide 12% (Pharmacia Phast System. 10
–    15% gradient gels) và nhuộm gel bằng Coomasie Blue R250.
+ Xác ñịnh nồng ñộ protein tái tổ hợp LTB bằng Western blot, sử dụng kháng thể ñặc hiệu kháng LTB