BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TÌM ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN TRÊN VÙNG AZF CỦA NHIỄM SẮC THỂ Y Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NAM VÔ SINH VÔ CĂN
BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TÌM ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN TRÊN VÙNG AZF CỦA NHIỄM SẮC THỂ Y Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NAM VÔ SINH VÔ CĂN
Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y đã được xác đinh có liên quan đến tình trạng rốì loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng thành tinh trùng. Trước đây chưa có kỹ thuật phát hiện thường quy loại đột biến này cho các bệnh nhân nam đến khám tại các khoa Hiếm muộn và Nam khoa. Bên canh đó, theo một số’ nghiên cứu tại Châu Á, tần suất đột biến này trong khoảng 8-10% (trong quần thể bệnh nhân nam vô sinh vô căn)(1’2’3’6’7>. Vì vậy, đây là một nguyên nhân gây vô sinh chiếm tỷ lệ không nhỏ mà hiện nay đã có thể phát hiện được. Phòng xét nghiệm Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch đã hoàn thiện được một số’ điều kiện kỹ thuật của xét nghiệm này. Do đó, trước khi áp dụng thường quy tại các phòng xét nghiệm ở nước ta, chúng tôi tiến hành kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến mất đoạn vùng AZF cho một số bệnh nhân nam vô sinh.
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bệnh nhân nam người Việt Nam (hoặc gốc Việt Nam), bị vô sinh vô căn, được chẩn đoán tại khoa Hiếm Muộn BV. Từ Dũ. Tiêu chuẩn chẩn đoán: bệnh nhân bình thường về’ lâm sàng và nhiễm sắc thể đồ (46,XX), chẩn đoán vô sinh dựa trên tiền căn (vợ chồng trong độ tuổi sinh sản sau 1 năm (vợ < 35 tuổi) hoặc 6 tháng (vợ > 35 tuổi) chung sống thực sự, không áp dụng biện pháp tránh thai nào mà vẫn không thể có thai và sinh con) và tinh dịch đồ (không thỏa tiêu chuẩn bình thường nào của tinh dịch đồ. Tinh dịch đồ được thực hiện hai lần cách nhau 2 tuần với thời gian kiêng xuất tinh trước thử từ 3 đến 5 ngày. Mẫu tinh dịch được hướng dẫn lấy đúng quy cách và được tiến hành đánh giá tại Phòng Xét Nghiệm Tinh Trùng (Khoa Hiếm Muộn BV Từ Dũ) theo tiêu chuẩn WHO năm 1999.
Bệnh nhân được gửi đến Phòng xét nghiệm Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch để làm xét nghiệm. 3mL máu ngoại biên được chống đông
bằng EDTA. Ly trích DNA bộ gen từ tế’ bào bạch cầu với tỷ số’ tinh khiết từ 1,8 – 2,0. Mỗi mẫu DNA được chạy 2 phản ứng Multiplex PCR cùng lúc, mỗi phản ứng khuếch đại 5 đoạn DNA đích (gồm 2 đoạn gen ZFY, SRY là chứng nội tại và 3 đoạn gen thuộc 3 vùng AZFa, b, c). Các cặp mồi sử dụng phát hiện được 95% trường hợp mất đoạn trên các vùng AZF. Chứng nam, chứng nữ (DNA của một người nam và người nữ bình thường) và chứng nước được chạy song song với mỗi mẫu DNA bệnh nhân. Nồng độ trong một phản ứng của Mg2+ là 6,5mM, của mồ’i là 2pmol mỗi loại và của dNTPs là 0,3mM. Lượng DNA sử dụng là 200ng/phản ứng. Chu kỳ nhiệt phản ứng là 950C 6′ , 940C 30″ , 550C 30″, 720C 60″ , 35 chu kỳ, 720C 10′. Chạy điện di ở 100V , 40 phút , gel agarose 2,5% , chất phát quang ethidium bromide, thước đo 100 đôi base. Đọc kết quả dưới đèn UV và chụp hình lưu lại.
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất