Bước đầu chẩn đoán trước sinh bệnh thoái hóa cơ tủy ở Việt Nam

 

 Bệnh lý di truyền chiếm khoảng 20% các trường hợp tử vong trong giai đoạn sơ sinh cũng như chiếm một tỉ lệ rất cao những bệnh lý gặp phải ở thời kỳ nhũ nhi và trẻ nhỏ [6]. Tần suất và mức độ nặng của các bệnh lý di truyền đơn gen thay đổi tùy theo từng chủng tộc và có thể chiếm đến 2% tổng số tất cả trẻ sơ sinh. Ở Việt Nam, theo thống kê của Nguyễn Văn Đông, tỉ lệ thai dị tật bẩm sinh ở bệnh viện Phụ Sản Trung Ương trong ba năm 2001 – 2003 là 2,7% [6].

 

Bệnh thoái hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy viết tắt là SMA) là  bệnh lý thần kinh cơ hay gặp được mô tả đầu tiên bởi Guido Werdnig năm 1891 [1]. Đây là bệnh di truyền lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường, do đột biến gen SMN nằm ở vị trí q13 trên nhiễm sắc thể số 5. Các nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh bệnh thoái hóa cơ tủy trên thế giới đã chứng minh: Gen SMN1 mã hóa một protein với đầy đủ chức năng,  gen  SMN2  mã  hóa  protein  khác  kém chức năng hơn do thiếu hụt exon 7, nucleotid C chuyển thành T tại exon 7 đã làm ảnh hưởng đến quá trình hoàn thiện mRNA gây xóa đoạn exon này. Exon 7, exon 8 đóng vai trò quan trọng với chức năng của protein vì vùng gen này mã hóa bởi phân tử protein có khả năng liên kết với một số protein tương đồng khác (protein neuron specific profilin II..). Đột biến exon 7 và exon 8 làm giảm khả năng tương tác protein- protein. Tuy vậy, các nhà khoa học đã chứng minh rằng chỉ có đột biến xóa đoạn exon 7 hoặc cả hai exon7 và exon 8 của gen SMN1 mới gây bệnh thoái hóa cơ tủy [2]. Theo nhiều nghiên cứu, bệnh thoái hóa cơ tủy gây nên do người bệnh nhận gen di truyền từ bố và mẹ dị hợp tử. Do vậy, việc chẩn đoán bố và mẹ dị hợp tử để phục vụ cho chẩn đoán trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường để phòng bệnh bằng phương pháp đình chỉ thai chủ động là một lựa chọn được nhiều người đồng thuận. Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán   trước sinh bệnh thoái hóa cơ tủy.

 

I. ĐỐI  TƯỢNG  VÀ  PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

 

1. Đối tượng nghiên cứu

 

 

 

– Nhóm đối chứng: 2 người bình thường gồm cả nam và nữ.

 

 

– Nhóm nghiên cứu: 2 thai phụ đã sinh con bị bệnh thoái hóa cơ tủy (bệnh nhân thoái hóa cơ tủy đã được xác định đột biến  exon 7 và exon 8 gen SMN1).

2. Phương pháp nghiên cứu

Kỹ thuật chọc hút dịch ối: Được thực hiện vào tuần thứ 14-16 của thai kỳ dưới sự hỗ trợ của siêu âm, kỹ thuật này được tiến hành tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương.

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối: Sử dụng môi trường Amniomax để tạo các  tế  bào sợi bám dính vào mặt bình nuôi cấy. Nuôi cấy theo phương pháp hở, tủ  ấm  370C với 5% CO2  và 95% không khí cùng nguồn ẩm. Thời gian trung bình nuôi  cấy là từ 7-15 ngày. Các tế bào ối thai nhi thu được với số lượng đủ để tách chiết DNA cho kỹ thuật phân tích gen .

Phản ứng PCR phân tích gen SMN1 của thai nhi

– Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch  đại exon 7, exon 8 được mô tả theo  phương  pháp của Van der Steege [9].

– Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích

20 µl gồm các thành phần: 100 ng DNA, 5 pmol primer, 200 µmol/l dNTP, 2 đơn vị Taq polymerase và 2  µl bufer II 20. Chu trình nhiệt 94oC- 7 phút, 35 chu kỳ [94oC – 60s, 55oC – 60, 72oC – 60s], 72oC – 7phút. Nghiên cứu sử dụng khuôn DNA của người bình thường làm mẫu đối chứng dương và sử dụng mẫu nước thay cho khuôn DNA làm mẫu đối chứng âm để loại trừ khả năng nhiễm DNA ngoại lai. Sản phẩm PCR có kích thước 190 bp.

II. KẾT QUẢ

Kỹ thuật RFLP xác định đột  biến xóa  đoạn exon7, exon 8 của gen SMN1: Áp dụng kỹ thuật RFLP theo phương pháp của Van der Steege, sản phẩm PCR sau khuếch đại exon 7, exon 8   được xử lý bằng enzym cắt DraI và DdeI (ủ 37oC trong 1 giờ). Enzym DraI không phân cắt  exon 7 của gen SMN1 mà phân cắt exon 7 của gen SMN2 thành hai đoạn có kích thước 170 bp và 20 bp; enzym Ddel không có vị trí phân cắt trên exon 8 của gen SMN1và phân cắt exon 8 của gen SMN2 thành hai đoạn có kích thước 120 bp và 70 bp. Sản phẩm sau xử lý với enzym cắt giới hạn sẽ được điện di trên gel agarose 3%. Như vậy, đối với exon 7, sản phẩm điện di sẽ có 2 vạch  rõ nét ở người bình thường: vạch trên là sản phẩm không cắt của  exon  7  gen  SMN1  và  vạch  dưới  là  sản phẩm bị phân cắt của exon 7 gen SMN2 có kích thước 170 bp, vạch  thấp có kích thước 20 bp của gen SMN2 bị phân cắt  không thấy được trên hình ảnh điện di; khi bệnh nhi có đột biến xóa đoạn exon 7 gen SMN1, hình ảnh điện di sản phẩm PCR sẽ có 1vạch có kích thước 170 bp. Đối với exon 8, sản phẩm điện di sẽ xuất hiện 3 vạch ở người bình thường: 2 vạch thấp là sản phẩm phân cắt exon 8  của gen SMN2 và 1vạch  cao là sản phẩm không bị phân cắt exon 8 của gen SMN1; khi bệnh nhi có đột biến xóa đoạn exon 8 của gen SMN1, trên hình ảnh điện di chỉ xuất hiện 2vạch thấp 120 bp và 70 bp (sản phẩm phân cắt exon 8  gen SMN2).

 

Mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán trước sinh bệnh thoái hóa cơ tủy (SMA). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 2 thai phụ có tiền sử sinh con bị bệnh thoái hóa cơ tủy; DNA được tách chiết từ tế bào ối của thai phụ;  Sử dụng kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymophism) để phân tích exon7, exon 8 của gen SMN1. Kết quả: 03 thai nhi được chẩn đoán không mắc bệnh thoái hóa cơ tủy. Kết luận: Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh thoái hoa cơ tủy thành công ở Việt Nam, mở ra triển vọng ứng dụng kỹ thuật RFLP trên lâm sàng.