Bước đầu nghiên cứu kiểu hình và nồng độ alpha-1-antitrypsin ở trẻ bị bênh gan mật chưa rõ nguyên nhân
Alpha 1 antitrypsin (A1AT) là một chất ức chế serin protease chính trong huyết tương được sản xuất tại gan. Thiếu A1AT phần lớn do đột biến trên gen SERPINA1 nằm trên NST 14 tạo ra các alen PI*S và PI*Z. Thiếu A1AT là nguyên nhân hay gặp nhất trong nhóm nguyên nhân di truyền gây bênh gan ở trẻ em (ứ mật sơ sinh, viêm gan mạn, xơ gan). Tại Việt Nam, bênh lý gan mật ở trẻ nhỏ gặp khá phổ biến, nhóm chưa chẩn đoán được nguyên nhân chiếm tỷ lệ lớn. Vì vậy việc điều trị còn gặp nhiều khó khăn. Mục tiêu: (1) Tìm hiểu nồng độ A1AT trong máu trẻ bị bệnh gan mật chưa rõ nguyên nhân. (2) Nghiên cứu kiểu hình A1AT bằng phương pháp điện di hội tụ đẳng điện. Phương pháp: 45 trẻ dưới 2 tuổi bị bệnh gan chưa rõ nguyên nhân được lấy máu định lượng nồng độ A1AT bằng kỹ thuật miễn dịch độ đục. Xác định kiểu hình bằng phương pháp điện di hội tụ đẳng điện. Kết quả: Nồng độ A1AT trong khoảng 40 to 210 mg/dl, trung bình 142 mg/dl. Xác định kiểu hình bằng IEF cho kết quả 91% PlMM, 4.4% PIMX, 4.4% PIMZ. Kết luận: nghiên cứu lần đầu tiên phát hiện được alen Z đột biến ở người Việt Nam.
1. Đặt vấn đề:
Alpha 1 antitrypsin (A1AT) là một glycoprotein gồm 394 acid amin, trọng lượng phân tử 52000, được mã hóa bởi gen SERPINA 1 (hay còn gọi là gen PI) nằm ở cánh dài nhiễm sắc thể 14 (14q31 – 32.3). Được tổng hợp ở gan, A1AT là một chất ức chế protease chính trong huyết thanh người, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ phổi không bị phá hủy bởi elastase của bạch cầu sinh ra trong phản ứng viêm [10] Đột biến trên gen SERPINA1 hay gặp nhát tạo ra các alen bất thường như Z, S. Hậu quả của đột biến gây tích lũy protein tại tế bào gan làm tổn thương gan và thiếu A1AT trong máu làm gia tăng nguy cơ bị khí phế thũng. [7], [8], [10]. Thiếu A1AT gặp ở nhiều nơi trên thế giới. Điều tra 4.4 tỷ người trên 58 quốc gia thấy có ít nhất 116 triệu người mang gen PiMS và PiMZ và 3.4 triệu người mang gen PiSS, PiSZ, PiZZ là những kiểu gen gây thiếu A1AT phổ biến nhất [5]
Thiếu A1AT gây xơ gan ở trẻ em do Sharp và cộng sự phát hiện lần đầu năm 1969. Tiếp tục nghiên cứu, người ta thấy rằng thiếu A1AT là nguyên nhân hay gặp nhất trong nhóm nguyên nhân di truyền gây bệnh gan ở trẻ em với biểu hiện lâm sàng đa dạng, khó phân biệt với các nguyên nhân khác: vàng da ứ mật kéo dài, gan lách to, xơ gan dẫn đến phải ghép gan. Một số bệnh nhân không có biểu hiện bệnh khi còn nhỏ mà khi lớn lên mới có triệu chứng gan lách to hoặc xơ gan [7]
Tại Việt Nam, bệnh lý gan mật ở trẻ nhỏ gặp khá phổ biến, nhóm chưa chẩn đoán được nguyên nhân chiếm tỷ lệ lớn (64,86% trường hợp viêm gan cấp, 54,22% trường hợp xơ gan, 30,73% viêm gan mạn) [3]. Các nghiên cứu về A1AT còn ít. Việc phát hiện thiếu A1AT gây bệnh gan mật ở trẻ em ngoài mục đích chẩn đoán và điều trị còn có ý nghĩa quản lý và tư vấn di truyền. Chẩn đoán thiếu A1AT dựa vào nồng độ A1AT trong huyết thanh và xác định kiểu hình bằng phương pháp điện di hội tụ đẳng điện là vấn đề cần thiết. Vì vậy, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu kiểu hình và nồng độ alpha-1-antitrypsin ở trẻ bị bênh gan mật chưa rõ nguyên nhân ” với những mục tiêu sau:
– Tìm hiểu nồng độ A1AT trong máu trẻ bị bệnh gan mật chưa rõ nguyên nhân.
– Nghiên cứu kiểu hình A1AT bằng phương pháp điện di hội tụ đẳng điện.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:
2.1. Đối tượng nghiên cứu :
45 trẻ từ sơ sinh đến 2 tuổi, được chẩn đoán bênh gan mật chưa rõ nguyên nhân điều trị tại khoa tiêu hóa gan mật bênh viên Nhi trung ương từ tháng 8/2008 đến tháng 8/2009.
2.2. Phương pháp nghiên cứu mô tả, tiến cứu
2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị và hoá chất :
– Máy sinh hoá tự động OLYMPUS AU-400 (Nhật Bản).
– Bộ điên di IEF model 111 Bio-Rad.
– Tủ lạnh sâu -30°C, -80°C (SANYO)
– Lò vi sóng (Samsung)
– Hoá chất định lượng A1AT, hãng Olympus (Nhật Bản).
– Hoá chất chạy điên di A1AT:
Isogel, Sorbitol, Pharmalyte pH 4,2 – 4,6, Gelbond film Kháng thể kháng A1AT Coomassie Brilliant Blue R 350 Dung dịch khử nhuộm
Mẫu kiểu hình M, S, Z, X.. được cung cấp bởi Monash Medical Centre, Australia
2.2.2 Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu :
2.2.2.1 Qui trình lấy mẫu:
Các bênh nhân đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu được lấy 2ml máu tĩnh mạch không
chống đông. Tại thời điểm lấy máu bênh nhân không có nhiễm trùng cấp. Thời gian lấy
máu thống nhất vào buổi sáng. Bênh phẩm được ly tâm tách huyết thanh trong vòng 2 h sau khi lấy máu. Huyết thanh được chia nhỏ và bảo quản ở -20° đến -80° được sử dụng để định lượng nồng độ và xác định kiểu hình alpha 1 antitrypsin.
2.2.2.2. Kỹ thuật định lượng nồng độ A1AT trong máu :
Nguyên tắc : Kỹ thuật miễn dịch đo độ đục.
A1AT kết hợp với kháng thể kháng A1AT tạo ra ngưng kết làm đục dung dịch. Độ đục của dung dịch tỷ lê thuận với nồng độ A1AT huyết thanh.
Cách tiến hành :
– Xây dựng đồ thị chuẩn: sử dụng 5 loại dung dịch chuẩn đã biết nồng độ theo
tiêu chuẩn IFCC CRM 470.
– Kiểm tra chất lượng bằng huyết thanh kiểm tra hãng Olympus.
– Huyết thanh bênh nhân 2^l được trộn đều với 200 |il thuốc thử 1 và 65 |il thuốc thử 2. Đo mật độ quang của dung dịch thu được theo phương pháp đo điểm cuối. Đối chiếu mật độ quang của mẫu thử so với đồ thị chuẩn để tính toán nồng độ A1AT.
2.2.2.3 Điên di hội tụ đẳng điên (isoelectric focusing – IEF) xác định kiểu hình A1AT: Nguyên tắc : phân tử protein A1AT di chuyển trong môi trường thang nồng độ pH (4.2 – 4.9) sẽ dừng lại ở điểm trùng với điểm đẳng điên của chúng. IEF được tiến hành trên gel agarose. Sau đó sử dụng kỹ thuật miễn dịch cố định để cố định lại các băng protein trên gel và nhận biết chúng bằng chất nhuộm Coomassie Briliant Blue R 350.
Các bước tiến hành :
– Tạo gel: cho 1g Sorbitol và 0.1g Isogel vào 10ml nước cất. Đun nóng cho tan. Trộn đều. Thêm 0.5ml Pharmalyte pH 4.2 – 4.9 vào hỗn hợp trên. Trộn đều tránh tạo bọt. Đổ hỗn hợp vào khuôn nhựa tạo gel. Đậy bằng Gel Bond film và để ổn định ở 4°C qua đêm.
– Nạp mẫu: nạp 1^l bênh phẩm hoặc mẫu kiểu hình vào các rãnh ở gần cực âm của gel. Mỗi bản gel đều phải gồm mẫu kiểu hình M, S, Z.
Thông tin này hy vọng sẽ gợi mở cho các bạn hướng tìm kiếm và nghiên cứu hữu ích