Chẩn đoán nhanh viêm loét giác mạc do nấm bằng kỹ thuật semi – nested pcr

Viêm  loét giác  mạc nhiễm  trùng  là một trong những  vấn  đề  sức  khỏe  có  tính chất  toàn  cầu. Bệnh rất phổ biến, đặc biệt ở những nước đang phát triển, là nguyên nhân chính trong nhóm các nguyên nhân gây mù lòa do bệnh lý giác mạc [6]. Các căn nguyên gây viêm loét giác mạc rất đa dạng, bao gồm cả vi khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng [4]. Thực tế, trong vài thập kỷ gần đây, tỷ lệ viêm  loét  giác  mạc  do nấm  gia tăng  một  cách đáng  quan ngại,  chiếm  tới  16 – 37% các  trường hợp  viêm  loét  giác  mạc  [5].  Mặc  dù  nấm  là nguyên nhân gây tổn thương giác mạc nặng nề nhất, nhưng nếu được chẩn đoán sớm, điều trị kịp thời sẹo giác mạc thường không dày và không làm giảm  thị lực  trầm  trọng  như các  nhóm  nguyên nhân khác [1]. Cho đến nay, chẩn đoán viêm loét giác mạc do nấm vẫn chủ yếu dựa vào hình ảnh tổn  thương trên  lâm  sàng  và  kết  quả  nhuộm  soi, nuôi cấy phân lập nấm. Tổn thương giác mạc do nấm mặc dù có những đặc điểm đặc trưng nhưng không phải lúc nào cũng rõ ràng và dễ dàng cho chẩn  đoán.  Kỹ thuật  nhuộm soi có độ nhạy  thấp nên đã bỏ sót không chẩn đoán được một tỷ lệ khá lớn các trường hợp bị bệnh. Quy trình nuôi cấy phân  lập  nấm  thất  bại  trong trường  hợp  các  loài nấm khó nuôi cấy hoặc chưa nuôi cấy được. Hơn nữa, việc nuôi cấy đòi hỏi vài ngày đến vài tuần mới cho kết quả nên làm chậm quá trình điều trị. Kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính xác căn nguyên  nấm  gây  viêm  loét  giác  mạc  là  một  yêu cầu cấp thiết để phục vụ cho công tác điều trị sớm cho bệnh nhân nhằm hạn chế tối đa di chứng sẹo giác mạc và tổn thương thị lực. Chính vì vậy mà nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu:
Áp  dụng  kỹ  thuật  semi – nested PCR phát hiện căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
–    10 chủng  nấm  thuộc các loài  Candida albi- cans, Aspegillus fumigatus, Fusarium spp.
–    Các  chủng  vi khuẩn  có  khả  năng  gây  viêm loét  giác  mạc  bao  gồm  Staphylococcus  epider- midis, Pseudomonas aeruginosa,  Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, và  tế  bào  bạch  cầu người được sử dụng như chứng (-) để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi dùng xác định nấm.
–    Bệnh phẩm chất nạo giác mạc của 20 bệnh nhân  được  chẩn  đoán  hoặc  nghi viêm  loét  giác mạc  do nấm,  và  2 bệnh  phẩm  của  bệnh  nhân được chẩn  đoán viêm loét giác mạc do vi khuẩn tại  Viện  Mắt  Trung ương. Bệnh  phẩm  được  lấy theo qui trình thường qui tại Viện Mắt Trung ương. 100µl dung dịch NaCl 0,9% sau khi rửa tiêu bản đã  soi tươi được  chuyển  vào  ống  eppendorff để tách chiết DNA cho PCR.
2.    Phương pháp nghiên cứu
–    Kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy phân lập nấm được thực hiện tại Labo Vi sinh, Viện Mắt Trung ương.
–    Quy trình tách chiết DNA và PCR được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh Y học, Đại học Y Hà Nội.
+ DNA được tách chiết bằng kít MasterPureTM DNA Purification Kit (USA).
+ PCR lần 1 sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 (AlphDNAA, Canada) [3] khuyếch  đại  đoạn  gen ITS (intergenic transcribed spacer) nằm giữa đoạn gen mã hóa  cho tiểu  phần 18S và 28S của  RNA ribosom. PCR lần  2 sử  dụng  cặp  mồi  ITS86 và ITS4 (Alpha DNA, Canada) [3] khuyếch đại đoạn gen ITS nằm giữa đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 5S và 28S của  RNA ribosom. Mỗi ống PCR chứa 25ml các thành phần với nồng độ như sau: MgCl2, 2 mM; dNTPs, 200 mM mỗi loại, AmpliTaq poly- merase, 0,025 UI; cặp mồi, và 5 ml DNA khuôn mẫu  (PCR lần  1). Ở  PCR lần  2, 1 ml sản  phẩm PCR lần  1 được  dùng làm khuôn mẫu. Chu trình

nhiệt để khuyếch đại các gen ITS được thực hiện như mô tả của  Ferrer và cộng  sự  [3]. Tất  cả các lần  làm PCR với bệnh phẩm  luôn luôn có chứng âm  và  chứng  dương chạy  cùng  các  mẫu  nghiên
cứu để loại trừ hiện tượng âm tính và dương tính

Viêm loét giác mạc do nấm là một bệnh lý nặng nề ở mắt, có thể dẫn đến sẹo giác mạc và mù lòa. Việc xác định căn nguyên nấm đến nay còn nhiều hạn chế. Mục tiêu: áp dụng kỹ thuật semi – nested PCR phát hiện căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 10 chủng nấm đã biết, 4 chủng vi khuẩn, 20 bệnh phẩm chất nạo giác mạc của bệnh nhân nghi ngờ nấm giác mạc, và 2 bệnh phẩm của bệnh nhân viêm loét giác mạc do vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này. Kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy phân lập nấm và semi – nested PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vùng Intergenic Transcribed Spacer (ITS) của các chủng nấm được áp dụng. Kết quả: Semi – nested PCR cho kết quả (+) đối với các chủng nấm được thử nghiệm và tất cả 20 bệnh phẩm nghi ngờ nấm giác mạc được phát hiện có nấm bằng phương pháp khác. PCR ( – ) trong thử nghiệm với các chủng vi khuẩn và bệnh phẩm chứa vi khuẩn. Kết luận: Semi – nested PCR là phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả các căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc.