Chẩn đoán nhiễm virus cúm a ở đường hô hấp bằng phân lập virus và kỹ thuật khuếch đại gen rt-pcr

Tâm Carlo Urbani, Đại Học Y Dược Huế Mục tiêu: Chẩn đoán virus cúm A và các dưới týp bằng dùng kết hợp phân lập virus cúm trên nuôi cấy tế bào và xét nghiệm khuếch đại gen.
Phương pháp: Phân lập virus cúm từ các mẫu bệnh phẩm hô hấp trên ở nuôi cấy tế bào MDCK và đồng thời dùng các kỹ thuật khuếch đại gen để xác định trực tiếp virus cúm A và các phân týp của cúm A từ mẫu bệnh phẩm.
Kết quả: Bốn mươi bệnh phẩm lấy ở đường hô hấp của 40 bệnh nhân nghi nhiễm cúm được chẩn đoán với 2 xét nghiệm trên, có 26 bệnh nhân ( tỷ lệ 65%) dương tính với virus cúm A, trong đó virus cúm A lợn đang gây dịch (H1N1sw) được phát hiện ở 20 bệnh nhân (có tỷ lệ 77%), virus cúm A mùa xác định ở 6 bệnh nhân ( tỷ lệ 23%) dương tính còn lại, không có trường hợp nào xác định nhiễm H3N2 và H5N1 trong nhóm bệnh nhân khảo sát. Kỹ thuật khuếch đại gen RT-PCR cho kết quả dương tính ở tất cả 26 mẫu ( tỷ lệ 100%) và cấy phân lập virus chỉ cho dương tính ở 20 bệnh nhân (tỷ lệ 77%) đã được xác định bởi RT-PCR.
Kết luận: Dùng cả hai phương pháp chẩn đoán virus học đặc hiệu để xác định virus cúm A và định các dưới týp ở mẫu bệnh phẩm hô hấp. Kết quả cho thấy virus cúm A được chẩn đoán với tỷ lệ cao và xác định rõ các phân týp gây bệnh.
1.    ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus cúm có 3 týp A, B và C, là tác nhân gây nhiễm trùng đường hô hấp ở người, trong đó virus cúm týp A thường gây nên các vụ dịch cúm ở người. Về mặt cấu trúc virus học, virus cúm có bao bên ngoài bằng lipid, trên bề mặt của bao ngoài có nhiều gai ngưng kết hồng cầu mang kháng nguyên H và gai neuraminidase mang kháng nguyên N. Dựa vào hai kháng nguyên này virus cúm týp A còn được chia thành nhiều dưới týp và hiện nay có 16 dưới týp với kháng nguyên H và 9 dưới týp với kháng nguyên N [1], [2].
Trong thiên nhiên virus cúm A có túc chủ là các loài động vật gồm các loài chim nước gọi là virus cúm A của chim; một số dưới týp có túc chủ là lợn ( virus cúm A lợn); virus cúm A ngựa; và chỉ một vài dưới týp virus cúm A phân bố ở người. Virus cúm A ở chim có thể thay đổi do đột biến gen hay do sự tổ hợp gen để trở thành các dưới týp mới và gây nên những vụ dịch cúm ở các loài động vật túc chủ mới như lợn và người.
Bệnh do virus cúm A ở người thường do một số dưới týp lưu hành là H2N2 (1957), H1N1 mùa, và H3N2. Tuy nhiên trong những năm gần đây một số dưới týp virus cúm A có nguồn gốc động vật có thể gây nhiễm trùng ở người gồm virus cúm chim H5N1 và rất gần đây là virus cúm A dưới týp H1N1 có nguồn gốc từ lợn ( swine H1N1) hiện đang gây nên đại dịch ở khắp nơi trên thế giới và đang lây lan mạnh ở Việt Nam [2].
Xác định sớm nhiễm virus cúm A giúp dùng thuốc chống virus sớm, đề ra biện pháp phòng và chống lây lan, đặc biệt với các dưới týp virus cúm có độc lực cao gây nhiễm trùng nặng như H5N1. Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán virus cúm bao gồm phân lập virus; xác định kháng nguyên virus cúm ở mẫu nghiệm hô hấp; xác định RNA của virus cúm bằng kỹ thuật phân tử và xác định kháng thể trong máu bệnh nhân. Chẩn đoán bằng phân lập virus hiện là phương pháp chuẩn, phương pháp này cần có phương tiện nuôi cấy tế bào và phải được thực hiện với những phòng thí nghiệm có mức an toàn sinh học cấp 3. Xác định kháng nguyên virus cúm trong mẫu nghiệm hô hấp bằng xét nghiệm nhanh có độ nhạy thấp (10 -70%) và không phân biệt được các dưới týp của virus cúm A, do vậy hiện không được Tổ Chức Y Tế Thế Giới (TCYTTG) khuyên dùng để theo dõi dịch cúm [3]. Xác định RNA của virus trong bệnh phẩm bằng kỹ thuật RT-PCR là phương pháp chẩn đoán nhanh và đặc hiệu, có thể thực hiện được ở các phòng thí nghiệm cấp 2 và phương pháp này hiện được TCYTTG khuyên dùng ở nhiều phòng thí nghiệm để chẩn đoán nhanh virus cúm [1]; xác định kháng thể chống virus cúm A trong huyết thanh người bệnh ít hửu ích vì cho kết quả chậm, thường chỉ dùng trong điều tra dịch tể học.
Để tham gia vào hoạt động giám sát nhiễm trùng virus cúm A trong những năm tới ở địa bàn Thừa Thiên Huế và các tỉnh miền Trung. Ở phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc trung tâm Carlo Urbani và bộ môn Vi sinh trường Đại Học Y Dược Huế, chúng tôi đã xây dựng có sẳn và đưa vào áp dụng hai phương pháp chẩn đoán virus cúm A gồm phân lập virus cúm trên nuôi cấy tế bào và các kỹ thuật khuếch đại gen RT-PCR để xác định virus cúm A và các dưới týp gây bệnh ở người. Bài báo này chúng tôi trình bày kết quả bước đầu áp dụng hai phương pháp chẩn đoán nêu trên trong xác định virus cúm A và định danh các dưới týp gây bệnh ở bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bị nhiễm virus cúm A mới trong thời gian vừa qua tại Thừa Thiên Huế .
2.    ĐỐI TƯỢNG- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.    Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi thực hiện chẩn đoán virus cúm A ở các bệnh nhân tuổi từ 3 đến 18 tuổi có triệu chứng hô hấp với lâm sàng nghi ngờ nhiễm H1N1 hoặc VPQ cấp do virus nhập viện tại bệnh viện thành phố Huế từ tháng 5/ 10 đến 15/ 11 năm 2009.
2.2.    Vật liệu nghiên cứu
2.2.1.    Sinh phẩm dùng phân lập virus cúm:
–    Môi trường vận chuyển virus (viral transport medium: VTM) của hảng Becton Dickinson
–    Tế bào MDCK ( Madm-Darby Canine Kidney cells ) ( ATCC CCL34)
–    Môi trường nuôi cấy tế bào MEM (pH 7.2) + 10% fetal bovine serum + dung dịch kháng sinh gồm penicillin [10 U/ml], streptomycin [10 mg/ml], and amphotericin B [0.25 mg/ml]), đệm
HEPES ( 25mM).
–    Dung dịch Trypsin 0,05% (1x), với EDTA, trypsin, TCPK
2.2.2.    Sinh phẩm cho kỹ thuật khuếch đại gen
–    Bộ sinh phẩm tách RNA của virus của hảng Qiagen ( Cat No: 52904),
–    Sinh phẩm cho kỹ thật khuếch đại là RT-PCR Master mix (2x), superscript III RT/Platinum Taq DNA polymerease của hảng Invitrogen.
–    Các chứng dương RNA của các virus H1N1sw ( viện Pasteur TP HCM), H1N1s (mùa ), H3N2 ( Viện San Raffaele, Milan)
–     Các gen mồi khuếch đại gen M của virus cúm A, và các gen mồi khuếch đại gen H1 của virus H1N1 (2009), gen mồi khuếch đại gen H1N1 mùa, gen mồi khuếch đại H3 của virus H3N2 và H5 của H5N1 theo khuyến cáo của TCYTTG như ở bảng 1. Tất cả gen mồi này được chọn từ các tài liệu [1], [2] và [5].