Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật Microsatellite
Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật Microsatellite.Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là bệnh lý di truyền thần kinh cơ hay gặp với tần suất 1/3600 trẻ trai. Đây là bệnh di truyền gen lặn kiên kết với NST giới tính X, không có alen tương ứng trên NST Y. Người mẹ là người lành mang gen bệnh có khả năng truyền gen bệnh và gây biểu hiện bệnh ở con trai với tỉ lệ 50%. Bệnh đặc trưng bởi sự yếu cơ tiến triển, người bệnhphụ thuộc xe lăn ở lứa tuổi 11-12 và thường tử vong ở lứa tuổi 20 do các biến chứng tim mạch và hô hấp. Hiện nay bệnh vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, vì vậy sàng lọc người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh vẫn đóng một vai trò quan trọng giúp giảm tỉ lệ sinh con mắc bệnh. Do Dystrophin là một gen có kích thước lớn, một số trường hợp không xác định được đột biến chỉ điểm ở người bệnh hay thai phụ, một số gia đình không có điều kiện kinh tế để làm các xét nghiệm chẩn đoán đột biến nên việc chẩn đoán trước sinh bằng các kỹ thuật chẩn đoán đột biến trực tiếp hiện còn gặp khó khăn. Kỹ thuật Microsatellite ra đời đã hứa hẹn mang đến hiệu quả cao trong chẩn đoán trước sinh DMD khi có thể được ứng dụng cho tất cả các dạng đột biến gen Dystrophin với thời gian trả lời kết quả nhanh (sau 48 -72 giờ) và chi phí thấp. Đề tài: “Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật Microsatellite” với hai mục tiêu:
1. Phát hiện người lành mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật MLPA.
2. Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne cho thai nhi của những bà mẹ là người lành mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật Microsatellite DNA.
2. Tính thời sự của luận án
Luận án được tiến hành khi bệnh DMD hiện nay vẫn là bệnh lý di truyền có tần suất cao trong nhóm bệnh lý thần kinh cơ và chưa có phương pháp điều trị khỏi bệnh. Các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh bệnh DMD hiện mới chỉ được thực hiện ở một số cơ sở y tế lớn tai Việt Nam và việc xác định đột biến gen Dystrophin còn gặp khó khăn do kích thước gen lớn, chi phí cho các xét nghiệm di truyền phân tử hiện nay còn cao. Kỹ thuật Microsatellite là một kỹ thuật xác định đột biến gián tiếp, có khả năng chẩn đoán trước sinh DMD cho thai nhi khi người mẹ mang đột biến xoá đoạn, lặp đoạn hay đột biến điểm. Đặc biệt kỹ thuật này là kỹ thuật duy nhất có thể ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh với những trường hợp không xác định được đột biến chỉ điểm ở thai phụ. Microsatellite là một kỹ thuật đơn giản, có giá thành thấp hơn các kỹ thuật MLPA hay giải trình tự gen. Do đó việc xác định người lành mang gen bệnh và ứng dụng kỹ thuật Microsatellite trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD là cần thiết.
3. Những đóng góp khoa học trong luận án
– Đây là nghiên cứu khoa học đầu tiên tại Việt Nam vềchẩn đoán trước sinh bệnh DMD bằng kỹ thuật Microsatellite.
– Nghiên cứu đã chỉ ra việc xác định người lành mang gen bệnh và tư vấn di truyền cho tất cả các thành viên nữ trong phả hệ gia đình bệnh nhân DMD là hết sức cần thiết. Thông qua việc xác định được các trường hợp đột biến thể khảm, nghiên cứu đã cho thấy vẫn cần tư vấn di truyền cho những thành viên nữ trong phả hệ cho dù không tìm thấy đột biến từ mẫu máu. Nghiên cứu đã tiến hành xác định người lành mang gen bệnh cho 85 thành viên nữ và kết quả có 52 người mang gen đột biến dị hợp tử (61%) và 33 người không mang gen đột biến (39%).
– Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật Microsatellite trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD, cho kết quả tương đồng với các kỹ thuật chẩn đoán đột biến trực tiếp; và cho thấy Microsatellite là một kỹ thuật với nhiều ưu điểm trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 136 trang, gồm: Đặt vấn đề và mục tiêu nghiên cứu (2 trang), tổng quan (34trang), đối tượng và phương pháp nghiên cứu (15trang), kết quả nghiên cứu (52trang), bàn luận (31 trang), kết luận (1 trang) và khuyến nghị (1 trang). Luận án có 14 bảng và 61 mục hình ảnh. Luận án có 125 tài liệu tham khảo bao gồm 6 tài liệu tiếng Việt và 119 tài liệu tiếng Anh, có 77 tài liệu trong 10 năm gần đây.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) lần đầu được mô tả năm 1852 bởi Edward Meryon. Năm 1861, Guillaume Duchenne đã ứng dụng dòng điện để kích thích cơ trong điều trị cho người bệnh mắc loạn dưỡng cơ. Năm 1879, Gowers mô tả bệnh DMD ở 220 người bệnh. Năm 1981, Zatz đã phát hiện gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21. Năm 1993, cấu trúc gen Dystrophin được mô tả đầy đủ. Năm 1989, glucocorticoid lần đầu được đưa vào điều trị DMD. Năm 1990, liệu pháp gen điều trị bệnh DMD được tiến hành trên chuột mdx. Năm 1999, liệu pháp tế bào gốc được nghiên cứu. Năm 2003, nghiên cứu liệu pháp gen điều trị DMD sử dụng chuỗi nucleotide ngắn không mã hóa và năm 2008, liệu pháp này được áp dụng điều trị trên người bệnh.
1.2. Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị bệnh DMD
1.2.1. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng về vận động: Bệnh đặc trưng bởi sự yếu cơ tiến triển có xu hướng từ gần đến xa. Triệu chứng yếu cơ xuất hiện rõ khi trẻ ở giai đoạn tập đi. Người bệnh mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và tử vong ở độ tuổi 20 do các bệnh lý tim mạch và hô hấp.
Triệu chứng tại các cơ quan khác:Chậm phát triển trí tuệ nhẹ, các bệnh lý tim mạch.
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
Nồng độ Creatine Kinase (CK): Trong bệnh DMD, nồng độ CK tăng cao ít nhất 40 lần ngay sau sinh, trước khi có triệu chứng lâm sàng.
Sinh thiết cơ: Sinh thiết cơ thấy hình ảnh các tế bào cơ thoái hóa, teo nhỏ, tổ chức liên kết quanh sợi cơ tăng sinh. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang không thấy protein Dystrophin trên bề mặt tế bào cơ.
Thăm dò điện sinh lý cơ: không đặc hiệu cho bệnh DMD.
Xét nghiệm di truyền phát hiện đột biến gen Dystrophin:Kỹ thuật PCR phát hiện đột biến xoá đoạn. Kỹ thuật MLPA phát hiện các đột biến xóa đoạn, lặp đoạn.Kỹ thuật giải trình tự genxác định đột biến điểm.
Các xét nghiệm khác: Xét nghiệm đánh giá chức năng tim mạch, X-quang tim phổi,…đánh giá tình trạng chung của người bệnh.
1.2.3. Điều trị và dự phòng
Hiện nay chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, hiện nay chỉ điều trị các biến chứng của bệnh và cải thiện chất lượng cuộc sống người bệnh.
* Điều trị nội khoa
Corticosteroids:Glucocorticoid giúp làm giảm tình trạng hoại tử cơ, cải thiện sức mạnh và chức năng của cơ.
Kiểm soát các biến chứng tim mạch và hô hấp
* Vật lý trị liệu và phục hồi chức năng: Các liệu pháp vật lý trị liệu giúp giảm nhẹ tình trạng co cứng cơ, giúp tăng cường sức mạnh cơ.
* Chế độ dinh dưỡng:Đảm bảo chế độ dinh dưỡng tốt và kiểm soát cân nặng của trẻ nhằm tránh tình trạng béo phì.
* Liệu pháp gen: Sử dụng các vector đưa vào cơ các đoạn nucleotid ngắn không mã hóa để bỏ qua một số exon trong quá trình dịch mã nhằm khôi phục lại khung đọc mở trong gen Dystrophin bị đột biến.
*Liệu pháp tế bào: chuyển ghép nguyên bào cơ nuôi cấy trong phòng thí nghiệm từ cơ trưởng thành của người thân không mắc bệnh để thay thế các tế bào cơ bệnh lý.
*Dự phòng: Phát hiện người lành mang gen bệnh, tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán tiền làm tổDMD.
1.3. Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
1.3.1. Cơ chế di truyền: Di truyền gen lặn liên kết NSTX, không có alen tương ứng trên NST Y. Mẹ là người lành mang gen bệnh sẽ truyền gen bệnh cho con và gây biểu hiện bệnh ở con trai với tỷ lệ 50%.
1.3.2. Cấu trúc gen Dystrophin: Gen Dystrophin nằm trên NST X, thuộc nhánh ngắn, vùng 2, băng 1, băng phụ 2, dài hơn 2000kb gồm 79 exon.
1.3.3. Cấu trúc, chức năng Protein Dystrophin
Cấu trúc protein Dystrophin: gồm 3685 acid amin, hình que gồm bốn phần: vùng giàu cystein, C-tận, N-tận, trung tâm rod.
Chức năng Protein Dystrophin: bảo vệ tính ổn định của màng tế bào
cơ. Khi thiếu Dystrophin dẫn đến hoại tử tế bào cơ.
1.3.4. Các dạng đột biến gen Dystrophin
* Đột biến xoá đoạn: 60-65% các đột biến, tập trung chủ yếu ở hai vùng “hot spot” là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’ của gen.
* Đột biến lặp đoạn: chiếm 5 -10% các trường hợp đột biến.
* Đột biến điểm: 25%-30%,xuất hiện rải rác ở tất cả các vị trí của gen.
1.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
1.4.1. Các kỹ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh
* Chọc hút nước ối: tiến hành qua thành bụng dưới hướng dẫn của siêu âm. Các tai biến bao gồm sẩy thai: 0,1-1%; rỉ ối: 1-2%; nhiễm trùng,…
* Sinh thiết gai rau: thực hiện ở tuần thứ 10 – 13, qua cổ tử cung hoặc qua thành bụng. Tai biến bao gồm sẩy thai, rỉ ối và nhiễm trùng (>1%).
* Lấy máu cuống rốn, sinh thiết mô thai
1.4.2. Các kỹ thuật di truyền ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
1.4.2.1. Các kỹ thuật phát hiện đột biến trực tiếp
* Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động:Sử dụng 4 màu huỳnh quang để đánh dấu 4 loại ddNTP, sử dụng hệ thống điện di mao quản.
* Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới NGS
* Kỹ thuật Southern Blotting: Phân tử DNA được cắt thành các đoạn nhỏ, điện di trên thạch agarose rồilai với các oligonucleotid đặc hiệu có gắn chất đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang.
*Kỹ thuật PCR: Kỹ thuật PCR áp dụng trong phát hiện đột biến gen Dystrophin: PCR đơn mồi, PCR đa mồi, PCR lồng, PCR sao chép ngược.
* Kỹ thuật FISH: Sử dụng DNA dò có đánh dấu đồng vị phóng xạ hoặc hóa họcđể dò tìm DNA đích trên NST của tế bào ở gian kỳ hoặcở kỳ giữa, phát hiện đột biến gen bằng kính hiển vi huỳnh quang.
* Kỹ thuật MLPA: Trong chẩn đoán bệnh DMD, kỹ thuật MLPA có thể khảo sát toàn bộ 79 exon, được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến gen Dystrophin và phát hiện người lành mang gen bệnh.
1.4.2.2. Kỹ thuật phát hiện đột biến gián tiếp: Kỹ thuật Microsatellite
Microsatellite được phát triển dựa trên kỹ thuật PCR tiêu chuẩn, sử dụng mồi gắn huỳnh quang và máy giải trình tự gen để xác định các sản phẩm PCR. Kỹ thuật dựa trên các thông tin đa hình của các đoạn trình tự lặp ngắn (STR). Kỹ thuật có độ nhạy cảm rất cao, gấp 1000 lần so với phân tích gel thông thường cho phép phát hiện được những tín hiệu rất yếu.Microsatellite trong chẩn đoán trước sinh DMD sử dụng trình tự lặp ngắn trong gen Dystrophin gắn huỳnh quang.
1.4.3. Chẩn đoán tiền làm tổ bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Chẩn đoán tiền làm tổgiúp xác định những phôi mang đột biến và chuyển vào buồng tử cung những phôi không mang đột biến.
1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
1.5.1. Trên thế giới
Bệnh DMD đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay trên thế giới. Tác giả
Thomas W. Prio năm 2005 đã xây dựng bản đồ đột biến gen dựa trên 361 người bệnh DMD.Năm 2006, tác giả Lai K.K đã ứng dụng kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến ở người bệnh DMD/BMD và người nữ mang gen bệnh. Năm 2009, tác giả Li đã kết hợp kỹ thuật MLPA và Multiplex PCR chẩn đoán trước sinh bệnh DMD. Năm 2011, tác giả Giliberto đã chẩn đoán trước sinh bệnh DMD qua kết hợp kỹ thuật Multiplex PCR và phân tích STR (Microsatellte). Năm 2013, tác giả Li đã ứng dụng kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán trước sinh DMD.
1.5.2. Tại Việt Nam
Bệnh DMD lần đầu được thống kê tại Việt Nam năm 1991 bởi tác giả Nguyễn Thu Nhạn với 131 người bệnh trong 107 gia đình. Năm 2004, tác giả Trần Vân Khánh đã xác định đột biến gen Dystrophin ở 85 người bệnh mắc bệnh DMD và BMD ở Việt Nam bằng phương pháp PCR. Năm 2009, Nguyễn Khắc Hân Hoan đã sử dụng kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến gen Dystrophin ở 11 người bệnh mắc bệnh DMD. Năm 2016, Trần Vân Khánh đã ứng dụng kỹ thuật Microsatellite trong chẩn đoán tiền làm tổ bệnh DMD cho 3 gia đình.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Cỡ mẫu: lấy mẫu chủ đích
– Mục tiêu 1: cỡ mẫu dự kiến là 50 thành viên nữ.
– Mục tiêu 2: cỡ mẫu dự kiến là 30 thai phụ.
2.1.2.Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu
– Mục tiêu 1: Các thành viên nữ trong phả hệ gia đình bệnh nhân DMD gồm: bà ngoại, mẹ, bác gái, dì, chị/em gái ruột, chị/em gái họ (con bácgái, dì), cháu gái (con của chị/em gái) của người bệnh DMD.
– Mục tiêu 2: Thai phụ mang thai 17-25 tuần, được xác định là người lành mang gen bệnh hoặc có tiền sử sinh con mắc DMD và có nguyện vọng được chẩn đoán trước sinh DMD cho thai nhi.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ
Bộ dụng cụ thực hiện thủ thuật chọc ối, hệ thống giải trình tự gen Beckman CEQ-8000, máy quang phổ kế Thermo Electron Corporation của hãng Biomate, máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf, lò vi sóng, tủ ấm, pipet, đầu côn, ống Falcol, cóng đo sạch.