Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne trên tế bào ối bằng phương pháp Multiplex pcr

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular dystrophy (DMD)) là  bệnh  di truyền  lặn  liên  kết nhiễm sắc thể X có tần số mắc cao nhất trong các bệnh cơ ở trẻ em. Những đột biến gen dystrophin là nguyên nhân gây ra bệnh [1]. Gen dystrophin nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể X (Xp2.1) và là gen lớn nhất của người với chiều dài 3000 Kb, chứa  79 exon. Gen này  phiên  mã  ra mARN 14 Kb và  tổng  hợp  protein dystrophin tham gia vào cấu trúc và bảo vệ màng tế bào cơ [1]. Những bệnh nhân bị đột biến gen dẫn tới không tổng hợp được  dystrophin làm  cho màng  tế bào  cơ bị huỷ hoại khi co cơ, giải phóng creatine kinase (CK) vào máu  hậu  quả  là gây  nên  các  triệu  chứng  teo cơ, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành vì tổn thương cơ tim và suy hô hấp [1].

Các  nhà  nghiên  cứu  trên  thế  giới  đã  nghiên cứu đột biến gen cho thấy, đột biến gen bao gồm các dạng: Mất đoạn là chủ yếu chiếm 50 – 65%,

nhân đoạn từ 2 – 7%, còn lại là đột biến điểm và chuyển đoạn. Các đột biến mất đoạn gen dystrophin thường tập trung vào 2 vùng “hot spots” còn gọi là điểm nóng hay xẩy ra mất đoạn: Vùng tận cùng 5 của gen từ exon 1 – 19 và vùng trung tâm của gen từ exon 43 – 60 [5, 6].

Đối với những bệnh di truyền tiên lượng nặng như bệnh DMD xu hướng chung của thế giới là phát  hiện  đột  biến  gen ở  bệnh  nhân,  phát  hiện đột biến gen cho những người nữ lành mang gen bệnh liên quan với bệnh nhân (carriers), tư vấn di truyền  và  áp  dụng  chẩn  đoán  trước  sinh  cho những gia đình với đột biến đã biết sẽ góp phần quan trọng vào việc phòng tránh sinh con bị bệnh DMD [5, 6, 8, 9].

Ở nước ta hiện nay các nhà nghiên cứu đang quan tâm áp dụng một số kỹ thuật di truyền phân tử để phát hiện các dạng đột biến gen ở các bệnh nhân  di truyền  và chẩn  đoán  trước  sinh cho các gia đình với những đột biến đã biết. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh phát hiện DNA phôi thai trong tế  bào  máu  mẹ  cũng  đã  được  nghiên cứu  [3], phương pháp  phát  hiện  đột  biến  mất đoạn gen dystrophin ở bệnh nhân DMD bằng phương  pháp  multiplex  PCR  và  phương  pháp phát hiện người lành mang gen bệnh DMD (carriers) cũng  đã  được  nghiên  cứu  và  bắt  đầu ứng  dụng  để  giúp  tư vấn  di truyền  cho các  gia đình mang gen bệnh [2, 4].

Trong các dạng đột biến gen gây bệnh DMD, đột biến mất đoạn chiếm đa số. Vì vậy phát hiện đột biến mất đoạn ở bệnh nhân DMD và chẩn đoán  trước  sinh cho các  bà  mẹ  đã  sinh con bị bệnh DMD với đột biến mất đoạn đã trở nên nhu cầu cấp thiết và được quan tâm hàng đầu.

Để phát hiện đột biến mất đoạn gen dystro- phin các phòng thí nghiệm trên thế giới thường sử dụng tối thiểu từ 18 đến 25 cặp mồi để bao vây 18 đến 25 exon thuộc 2 vùng“ hot spots” để tăng khả  năng  phát  hiện  đột  biến  mất  đoạn  gen và chẩn đoán trước sinh đối với các gia đình có tiền sử sinh con bị bệnh DMD. Xuất  phát  từ  thực  tế  trên,  đề  tài  này  nhằm  2

mục tiêu:

1. Hoàn chỉnh kỹ thuật Multiplex PCR với 25 cặp  mồi  của  gen  Dystrophin  trên  mẫu  ADN chiết tách từ tế bào ối trực tiếp và qua nuôi cấy.

2. Chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh  DMD  dùng  kỹ thuật Multiplex PCR .

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

– Nhóm  chứng:  20 thai phụ  bình thường  có thai từ tuần thứ 13 – 18 được chọc dò dịch ối để lấy mẫu.

– Nhóm bệnh: 2 thai phụ có tiền sử sinh con bị bệnh DMD được áp dụng chẩn đoán trước sinh và 2 bệnh nhân DMD của 2 gia đình này được phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin.

Phương pháp nghiên cứu:

– Mỗi  thai phụ  được  lấy  2 tuýp  dịch ối,  mỗi tuýp từ 6 → 8 ml (vô trùng và không lẫn máu) .

– Mỗi tuýp dịch ối được ly tâm 3000 vòng/ 15 phút để thu tế bào ối: Một tuýp tế bào được dùng để chiết tách ADN từ tế bào ối trực tiếp, một tuýp dùng để nuôi cấy sau 10 ngày thu hoạch và chiết tách ADN. ADN từ tế bào ối được chiết tách bằng phương pháp Qiagen kit, mẫu ADN sau khi chiết tách được đo OD260  nm và được kiểm tra độ tinh sạch bằng đo tỉ số mật độ quang OD260 nm/ OD280 nm và tính toán nồng độ ADN của mẫu.

– Sau đó các mẫu ADN từ tế bào ối trực tiếp và nuôi cấy được tiến hành phản ứng Multiplex PCR với 25 cặp mồi của gen dystrophin chia làm 3 tổ hợp phản ứng: (tổ hợp A) với 9 cặp mồi để tăng lượng 9 exon của gen dystrophin 45, 48, 19, 17, 51, 8, 12, 44, 4; (tổ hợp B) với 9 cặp mồi để tăng lượng vùng promoter cơ (Pm) và 8 exon tương ứng của gen dystrophin 3, 43, 50, 13, 6, 47, 60, 52; (tổ  hợp  C)  với  7  cặp  mồi  để  tăng  lượng  vùng promotor não (Pb) và 6 exon 49, 42, 41, 34, 32,

16. Các kỹ thuật trên được tiến hành tại bộ môn Y sinh học – Di truyền và Phòng Di truyền Phân tử bệnh viện Nhi Trung ương.

– 25 cặp mồi được thiết kế theo Chamberlain và Beggs năm 1990.

– Phản ứng Multiplex PCR được thực hiện trong thể tích 25 µl với các thành phần chính như sau: Buffer taq, dNTP, MgCl2, 1,25 unit  Hot  star Taq DNA polymerase, 100 ng ADN mẫu, primer mỗi loại, nước vừa đủ 25 µl.

– Phản ứng Multiplex PCR được thực hiện theo chương trình: khởi đầu là 950C /15 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ: 950C /30 giây, 530C/30 giây, 650C/ 40 giây và cuối cùng là 650C kéo dài 10 phút. Các tổ hợp khác thì nhiệt độ gắn mồi thay đổi tuỳ từng tổ hợp. Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 3% và nhuộm ethidium bromid 0,5 µg/ml.

– Đọc  kết  quả dưới  đèn  tử ngoại  UV, kết  quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu được đọc so với Marker thang chuẩn 100bp. Ở người nam bình thường hoặc thai nam bình thường trên hình ảnh điện di sẽ xuất hiện các băng đặc hiệu tương ứng với   sản   phẩm   PCR  của   23   exon  và   2  vùng promotor cơ (Pm), promotor não (Pb). Ở bệnh nhân DMD hoặc thai nam đột biến mất đoạn exon nào sẽ không có băng đặc hiệu cho exon đó.

– Hai thai phụ  có  tiền  sử  sinh con bị  bệnh DMD được chọc ối từ tuần thứ 15 và tuần thứ 18, các  mẫu  ADN từ  tế  bào  ối  của  2 thai  phụ  được chiết tách ADN.

+ 2 bệnh nhân DMD của 2 thai phụ được chiết tách ADN từ máu để phát hiện đột biến mất đoạn gen bằng phản ứng multiplex PCR với 25 cặp mồi.

+ Mẫu ADN của thai được sàng lọc bước 1 để xác  định giới  tính của  thai bằng  phương pháp multiplex PCR với  2 cặp  mồi:  cặp  mồi  DQ để tăng  lượng  một  đoạn  ADN kích thước  239/242 cặp bazơ (bp) trên nhiễm sắc thể số 6 có mặt ở cả người nam và nữ, cặp mồi TDF1 và TDF2 để tăng lượng vùng gen SRY (Sex determining region Y gene) kích thước 139 bp có gen TDF biệt hoá tinh hoàn (testis determining factor). Kết quả PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và nhuộm gel bằng Ethidium bromide 0,5 µg/ml, rồi đọc dưới đèn cực tím, nếu là thai nam sẽ xuất hiện 2 băng đặc hiệu 139 bp cho vùng  gen SRY có chứa  gen biệt  hoá tinh hoàn (TDF) và băng 239/ 242 cặp bazơ cho HLA – DQ. Nếu là thai nữ sẽ chỉ xuất hiện băng 239/242 bp đặc  hiệu  cho HLA – DQ∝ ở  người.

Nếu  là  thai  nam  sẽ  tiến  hành  bước  2:  dùng phương pháp Multiplex PCR với 25 cặp mồi, tiến hành song song với mẫu ADN từ máu bệnh nhân của gia đình này. Nếu mất đoạn gen được phát hiện ở bệnh nhân thì mẫu ADN của thai được so sánh  với  ADN của  bệnh  nhân  và  rút  ra kết  luận thai bình thường  hay thai đột  biến  giống  bệnh nhân của gia đình và tư vấn cho gia đình dựa trên kết quả xét nghệm phân tích ADN.