Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược
Luận văn Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization).Thalassemia là một dạng bệnh của huyết sắc tố – hemoglobin (HST – Hb) phổ biến trên thế giới. Bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân là do đột biến gen gây giảm hoặc không tổng hợp protein globin tham gia cấu tạo Hb, dẫn đến thiếu hụt Hb trong hồng cầu. Trên thế giới, ước tính 7% dân số mang gen bệnh và mỗi năm có khoảng 300.000 ^ 500.000 trẻ được sinh ra với thể đồng hợp tử nặng của bệnh này [1]. Tại Việt Nam, có khoảng hơn 5 triệu người mang gen và bị bệnh Thalassemia, hàng năm có thêm 100.000 trẻ mang gen bệnh và 1.700 trẻ mắc bệnh nặng do đột biến cả 2 gen được sinh ra [2].
Bệnh được chia làm 2 loại chính là alpha thalassemia (a-thalassemia) và beta thalassemia (P-thalassemia) tùy thuộc vào loại đột biến xảy ra ở gen a (quy định tổng hợp chuỗi alpha globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 16) hay gen p (quy định tổng hợp chuỗi beta globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 11). Theo thống kê, có trên 300 đột biến gen a và trên 200 đột biến gen p có liên quan đến bệnh Thalasemia [3], [4]. Cá thể đồng hợp tử mang 2 alen đột biến a- thalassemia loại –SEA/–SEA gây bệnh Hb Bart’s, đây là thể nặng nhất của bệnh a-thalassemia. Thai nhi mắc Hb Bart’s thường bị phù rau thai, thai chết lưu trong tử cung hoặc chết sớm sau sinh. Thể này đặc biệt phổ biến ở các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Philippines [5]. Bệnh nhân p- thalassemia thể nặng hay còn gọi là thể Cooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau, thường có biểu hiện thiếu máu nặng dần sau 3 ^ 6 tháng tuổi, phụ thuộc vào truyền máu và thải sắt suốt đời [5]. Người bệnh Thalassemia thể ẩn là người có kiểu gen dị hợp tử mang 1 alen đột biến, có thiếu máu nhược sắc trên huyết đồ nhưng lại không có biểu hiện trên lâm sàng. Phương pháp điều trị chủ yếu hiện nay đối với bệnh Thalassemia vẫn là truyền máu, thải sắt, cắt lách và điều trị các biến chứng khi cần [6], [7], [8].
Quá trình này rất tốn kém mà hiệu quả không cao. Vì thế, bệnh trở thành gánh nặng không chỉ cho bệnh nhân và gia đình mà cho toàn xã hội [9]. Đối với các trường hợp gia đình có bố mẹ là người mang gen bệnh hoặc tiền sử sinh con Thalassemia thì biện pháp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia có ý nghĩa quan trọng và là phương pháp phòng ngừa hiệu quả nhất [10].
Ở Việt Nam, để chẩn đoán bệnh Thalassemia chúng ta đang sử dụng phương pháp multiplex PCR (PCR đa mồi) để sàng lọc các đột biến: 5 đột biến mất đoạn lớn của gen a globin như: –SEA (South East Asia), –THAI (Thailand), –FIL (Philippin), -a42, -a37 và các đột biến điểm HbQs, HbCs và 8 đột biến phổ biến của gen p globin gây ra 95% các trường hợp p-thalassemia bao gồm: CD17 (AAG>TAG), CD41/42 (-TCTT), -28 (A>G), CD71/72 (+A), IVS 1.1 (G>T), IVS 1.5 (G>C), IVS 2.654 (C>T) và CD26 (GAG>AAG) [11], xác định kiểu gen bằng kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction) và giải trình tự vùng gen globin. Các phương pháp này dễ dàng áp dụng cho việc phát hiện các đột biến đơn lẻ đã biết, nhưng lại không có khả năng xác định cùng lúc nhiều đột biến. Hiện nay, kỹ thuật lai phân tử là một trong những kỹ thuật được dùng để chẩn đoán thay thế các phương pháp trên. Kỹ thuật Reverse hybridization (lai phân tử ngược) được cải tiến trên cơ sở của kỹ thuật lai phân tử có thể phát hiện cùng lúc được nhiều đột biến khác nhau trên cùng một gen. Kỹ thuật Reverse hybridization đã được ứng dụng hiệu quả trong xác định đồng nhiễm genotype virus sinh u nhú ở người (HPV). Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật này chưa được áp dụng trong chẩn đoán bệnh Thalassemia. Đây là một quy trình mới, có nhiều ưu điểm so với các phương pháp hiện đang được áp dụng, vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization) “, với mục tiêu:
1. Phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse hybridization trong chan đoán trước sinh.
2. Đánh giá giá trị của kỹ thuật Reverse hybridization trong chan đoán trước sinh bệnh Thalassemia.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization)
1. Cappellini M.D., Cohen A., Eleftheriou A. et al. (2008), Guidelines for the Clinical Management of Thalassaemia, second edition, Thalassemia International federation.
2. Nguyen Khac Han Hoan (2005). Thalasemie and a model of prevention in Viet Nam, The university of Sydney, Sydney.
3. Sand A.M. and Al-zzanie H.F. (2013). Molecular study on P-thalassemia patient in Iraq. Aizeopublisher.net, 4, 160-165.
4. John S.Waye and David H.K. Chui (2001). The a globin gene cluster: genetics and disorders. Clin. Invest. Med, 24(2), 103-109.
5. John Old (2013), Prevention of Thalassemias and other haemoglobin disorders, 2nd edition, Thalassemia International Federation.
6. Felicia L. Trachtenberg and Lauren Mednick (2012). Beliefs about chelation among Thalassemia patients, Heath and Quality of life outcomes.
7. Kamal Mansi, Talal Aburjaii, Mohamed Albashtawy et al. (2013). Biochemical factors relevant to kidney funtions among Jordanian children with P-thalassemia major treated with deferoxamin. International Journal of Medicine and Medical Sciences, 5(8), 374-379.
8. Dudley J. Pennell, James E. Udelson, Arai A.E. (2013). Cardio vascular function and treatment in P-thalassemia major: a consensus statement from the American Heart Association. Circulation, 128, 281-308.
9. Borgna-Pignatti C. and Gamberini M.R. (2011). Complications of thalassemia major and their treatment. Expert. Rev. Hematol, 4(3), 353-366.
10. Old J.M. (2003). Screening and genetic diagnosis of haemoglobin disorders. Blood reviews, 17(1), 43-53.
11. M.L. Saovaros Svasti, Tran Minh Hieu, Thongperm Munkongdee et al. (2002). Molecular analysis of beta-thalassemia in South Viet Nam. American Journal of Hematology, 71, 85-88.
12. R. M. Schultz and M.N. Liebman (1992), Protein II: Structure – Function relationship of protein families, Text book of biochemitry with clinical correlation, New York, 91-134.
13. Bạch Quốc Tuyên, Nguyễn Công Khanh (1991), Bệnh huyết cầu tố di truyền, Bài giảng Huyết học – Truyền máu, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
14. Trịnh Văn Bảo (2011), Di Truyền Y Học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, 99-104.
15. http: //ghr.nlm.nih.gov/gene/HBA 1.
16. Douglas R. Higgs (2013). The Molecular Basic of a-Thalassemia. Cold Spring Harb Perspect Med., 3(1), 101-171.
17. Renzo Galanello (2011). a-thalassemia. Genetics of Medicine, 13(2), 83-88.
18. Sammer A. Bleibel, Robert J. Leonard, Jennifer L. Jones-Crawford et al. (2000). Emedicine.
19. Martin H. Steinberg, Bernard G. Forget, Douglas R. Higgs (2009), Disorders of Hemoglobin. Second edition, Cambridge University Press, New York.
20. Rugless M.J. et al. (2008). A large deletion in the human a-globin cluster caused by a replication error is associated with unexpectedly mild phenotype. Hum Mol Genet, 17, 3084-3093.
21. David H.K. Chui and John S. Waye (1998). Hydrops Fetalis Caused by a-Thalassemia: An Emerging Health Care Problem. Bloodjournal, 91(7), 34-35.
22. H.H. Jr Kazazian, C.E. Dowling, P.G. Waber et al. (1986). The spectrum of beta thalassemia genes in China and Southeast Asia. The American Society of Hematology, 68, 964-966.
23. Nguyễn Công Khanh (1985), Một số đặc điểm lâm sàng và huyêt học bệnh fi-thalassemia ở người Việt Nam, Luận án Phó Tiến sỹ khoa học Y dược, Trường Đại học Y Hà Nội
24. Nguyễn Công Khanh (1993). Tần suất bệnh hemoglobin ở Việt Nam. Y học Việt Nam, 8, 11-16.
25. Nguyễn Đắc Lai, Lê Thị Sửu, Thái Quý và cộng sự. (1985). Sự lưu hành bệnh huyết sắc tố ở 1 số dân tộc ít người miền Bắc và miền Trung Việt Nam. Y học Việt Nam, 16-21.
26. Niehuis R.W. and Wolfe A. (1987), Disorders of Hemoglobin, Hematology of infancy and childhood, Saunders company, New York.
27. http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBB.
28. Antonio Cao, Vilma Gabutti, Giuseppe Masera et al. (1992). Điều trị thải sắt, Chuyên đề thalasemia. Y học Việt Nam (người dịch Tạ Thu Hòa- Nguyễn Công Khanh), 95-100.
29. Trần Văn Bé và cộng sự. (1997), Sử dụng Desferal trong bệnh Thalassemia, Chuyên đề thalasemia. Y học Việt Nam, 92-98.
30. Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực (1984). Một số đặc điểm về bệnh Beta Thalassemia. Y học thực hành, 1, 20-23.
31. A. Beauder (1996), Genetics and disease, Harrison principles of internal Medicine, USA, 365-409.
32. Old J. and Henderson S. (2010). Molecular diagnostics for haemoglobinopathies. Expert Opin. Med. Diagn, 4(3), 225-240.
33. Harteveld C. L., Kleanthous M., Traeger-Synodinos J. (2009). Prenatal diagnosis of haemoglobin disorders: present and future strategies. Clin Biochem, 42(18), 1767-1779.
34. Fabry M. and Old J. M. (2009), Laboratory methods for diagnosis and elevation of haemoglobin disorders, Disorders of Hemoglobin, 2nd Edition, Cambrige University Press, Cambrige, 658-686.
35. Old J.M. (2010), Prenatal Diagnosis of Haemoglobinopathies, Genetic Disorders and the fetus Sixth Edition, Blackwell Publishing, Oxford, 646-679.
36. Bowden D. K., Vickers M. A., Higgs D. R. (1992). A PCR-based strategy to detect the common severe determinants of a- thalassaemia. Brit JHaemat, 81,104-108.
37. Baysal E., Huisman T. H. J. (1994). Detection of common deletional a- thalassaemia-2 determinants by PCR. Am JHematol., 46, 208.
38. Liu Y. T., Old J. M., Fisher C. A. et al. (1999). Rapid detection of a- thalassaemia deletions and a-globin gene triplication by multiplex polymerase chain reactions. Brit J Haemat, 108, 295-299.
39. Chong S. S., Boehm C. D., Higgs D. R. et al. (2000). Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of a- thalassemia. Blood, 95, 360-362.
40. Dimovski A. J., Efremove D. G., Jankovic L. et al. (1993). A p0 thalassaemia due to a 1605 bp deletion of the 5’ p-globin gene region. Brit J Haemat, 85, 143-147.
41. Lynch J. R., Brown J. M., Best S. et al. (1991). Characterisation of the breakpoint of a 3.5 kb deletion of the p-globin gene. Genomics, 10, 509-511.
42. Craig J. E., Kelly S. J., Barnetson R. et al. (1992). Molecular characterisation of a novel 10.3 kb deletion causing p-thalassaemia with unusually high Hb A2. Brit J Haemat, 82, 735-744.
43. Waye J. S., Eng B., Chui D. H. K et al. (1994). Filipino p-thalassaemia due to a large deletion: identification of the deletion endpoints and polymerase chain reaction (PCR)-based diagnosis. Hum Genet, 94, 530-532.
44. Old J. M., Varawalla N. Y., Weatherall D. J. (1990). The rapid detection and prenatal diagnosis of beta thalassaemia in the Asian Indian and Cypriot populations in the UK. Lancet, 336, 834-837.
45. Thein S. L., Hesketh C., Brown K. M. et al. (1989). Molecular characterisation of a high A2 p thalassaemia by direct sequencing of single strand enriched amplified genomic DNA. Blood, 73, 924-930.
46. Craig J. E., Barnetson R. A., Prior J. et al. (1994). Rapid detection of deletions causing thalassemia and hereditary persistence of fetal hemoglobin by enzymatic amplification. Blood, 83, 1673-1682.
47. John Old, Cornelis L. Harteveld, Joanne Traeger-Synodinos (2012), Prevention of Thalassaemias and Other Haemoglobin Disorders, 2nd edition, Thalassemia International Federation.
48. Newton C. R., Graham A., Heptinstall L. E. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research, 17, 2503-2516.
49. Old J. M., Khan S. N., Verma, et al. (2001). A multi-centre study to further define the molecular basis of beta-thalassemia in Thailand, Pakistan, Sri Lanka, Mauritius, Syria, and India, and to develop a simple molecular diagnostic strategy by amplification refractory mutation system polymerase chain reaction. Hemoglobin, 25, 397.
50. Yong-Chui Wee, Kim-Lian Tan, Elizabeth Geogre et al. (2009). Molecular
characterisation of Haemoglobin Constant Spring and Haemoglobin Quong Sze with a Combine-Amplification Refractory Mutation System. Malaysian Journal of Medical Sciences, 16(3), 167-174.
51. Puehringer H., Najmabadi H., Law H.Y. et al. (2007). Validation of a reverse-hybridization StripAssay for the simultaneous analysis of common alpha-thalassemiapoint mutations and deletions. Clin. Chem. Lab. Med, 45(5), 605-610.
52. Lê Thị Hảo (2001). Nghiên cứu ứng dụng di truyền sinh học phân tử phát hiện đột biến gen gây bệnh P-thalassemia tại Việt Nam, Báo cáo khoa học, Trường Đại học Y dược TP Hồ chí Minh, TPHCM.
53. Department of molecular and clinical genetics – Royal Prince Alfred Hospital -Australia. Beta thalassemia protocols (2005).
54. Saiki R. K., Walsh P. S., Levenson C. H. et al. (1989). Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proceedings of the National Academy ofSciences, 86, 6230-6234.
55. Sutcharitchan P., Saiki R., Fucharoen S. et al. (1995). Reverse dot- blot detection of Thai beta-thalassaemia mutations. Brit J Haematol, 90, 809-816.
56. Giambona A., Lo Gioco P., Marino M. et al. (1995). The great heterogeneity of thalassemia molecular defect in Sicily. Human Genetics, 95, 526-530.
57. Hossein Najmabadi, Shahram Teimourian, Talayeh Khatibi et al. (2001). Amplification Refractory Mutation System (ARMS) and Reverse hybridization in the detection of beta-thalassemia mutations. Arch. Irn. Med., 4(4), 165-170.
58. Abdulalimov E. R., Asadov C. D., Mamedova T. A. et al. (2014). The comparative characteristic of two methods of detection of mutation of beta-globin gene. Klin Lab Diagn., 1, 56-59.
59. E. George, L. K. Teh, R. Rosli et al. (2012). Beta Thalassaemia Mutations in Malays: A Simplified Cost-effective Strategy To Identify the Mutations. Malaysian Journal of Medicine and Health Sciences, 8 (1), 40-49.
60. Pranee Winichagoon, Vannarat Saechan, Roongrat Sripanich et al. (1999). Prenatal Diagnosis of P-thalassaemia by Reverse Dot-blot Hybridization. Prenatal Diagnosis, 19, 428-435.
61. Nguyễn Khắc Hân Hoan, Phạm Việt Thanh, Trương Đình Kiệt và cộng sự. (2011). Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia trên 290 trường hợp thai. Tạp chí nghiên cứu y học, 3, 34-35.
62. Lý thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Ngô thị Tuyết Nhung và cộng sự (2015). Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước sinh bệnh Beta Thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ 2008-2015. Tạp chíy học Việt Nam, 434, 170-177.
63. Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai và cộng sự. (2010). Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước và sau sinh bệnh alpha Thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương. Tạp chí Nhi khoa, 3(3,4), 337-342.
64. Ali Ayçiçek, Ahmet Koç, Zeynep Canan Özdemir et al. (2011). Beta¬globin gene mutations in children with beta-thalassemia major from §anlmrfa province, Turkey. Turk. J. Hematol, 28, 264-268.
65. Guvenc B., Yildiz S. M., Tekinturhan F. et al. (2010). Molecular characterization of alpha-Thalassemia in Adana, Turkey: A single center study. Acta. Haematol., 123(4), 197-200.
66. Mohammad S. R., Sirous Zeinali, Abdolreza A. et al. (2011). ß- thalassemia mutations found during 1 year of prenatal diagnoses in fars province, Iran. Hemoglobin, 35(4), 331-337.
67. Douglas Wilson R. (2006). Early amniocentesis: risk assessement. Prenatal diagnosis, 35, 423-432.
68. Trần Danh Cường (2006), Một số nhận xét về dấu hiệu gợi ý của siêu âm ở những trường hợp thai nhi có bất thường nhiễm sắc thể, Hội nghị khoa học chuyên đề về chẩn đoán trước sinh, Sở y tế Hà Nội.
69. Nguyễn Thị Hoàng Trang (2011), Đánh giá kết quả chọc ối phân tích nhiễm sắc thể thai nhi tại Bệnh viện Phụ sản Trung Ương trong 5 năm 2006-2011, Luận văn thạc sỹ Y học, Hà Nội.
70. Zang lin, Zhang Xiao-hong et al. (2010). Prenatal cytogenetic diagnosis study of 2782 cases of high risk pregnant women. Chinese Medical Journal, 123(4), 423-443.
71. Rahimah Ahmad et al. (2013). Distribution of a Thallassemia Gene Variants in Diverse Ethnic Populations in Malaysia: Data from the Institue for Medical Research. Int. J. Mol. Sci., 14, 1859-1861.
72. X. M. Xu et al. (2004). The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassemia in Guangdong Province: implications for the future heath burden and population screening. J Clin Pathol, 57, 517-522.
73. Wibhasiris Srisuwan et al. (2013). Diagnosis of thalassemia carriers commonly found in Nothern Thailand via a combination of MCV or MCH and PCR-based methods. Bulletin Chiang Mai Associated Medical Sciences, 46, 22-32.
74. Fucharoen S. and Winichagoon (1992). Thalassemia in Southeast Asia: problems and strategy for prevention and control. Southeast Asia Journal of Tropical Medicine and Public Health, 23(4), 647-655.
75. Schu-Rern Chern, Chih-Ping Chen (2000). Molecular prenatal diagnosis of Thalassemia in Taiwan. International Journal of Gynecology & Obtetrics, 69, 103-106.
76. Jin Ai Mary A., Juan Loong K., Kim Lian T. et al. (2009). Thalassemia intermedia in HbH-CS disease with compound heterozygosity for P- thalassemia: Challenges in haemoglobin analysis and clinical diagnosis. Genes Genet. Syst, 84, 67-71.
77. Lý Thị Thanh hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai và cộng sự. (2011). Áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán trước và sau sinh bệnh beta thalassemia tại bênh viện Nhi Trung Ương. Tạp chí Nhi Khoa, 4, 67-73.
78. Bùi văn Viên, Dương Bá Trực, Nguyễn Công Khanh (1999). Nhận xét bước đầu cơ sở di truyền phân tử và mối quan hệ giữa kiểu gen với mức độ thiếu máu và thể tích hồng cầu trong bệnh HbE/p Thalassemia. tạp chí Nhi Khoa, 8, 123-129.
79. Filon D., Oppenheim A., Truc D. et al. (2000). Molecular analysis of beta thalassemia in Viet Nam. Hemoglobin, 24(2), 99-104.
80. Ngô Diễm Ngọc, Lý thị Thanh Hà, Ngô thị Tuyết Nhung và cộng sự. (2015). Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh a và p thalassemia trên các thai phụ nguy cơ cao tại bệnh viện nhi Trung ương. Tạp chí Y học Việt Nam, 434, 83-92.
81. Cornelis L. (2010). Review of alpha Thalassemia. Orphanet Journal of Rare Disease, 5, 13-19.
82. Kutlar F. (2008). An a2 Globin gene Initiation codon mutation in a vietnamese patient with HbH disease. Ann N Y Acad Sci, 398, 400.
83. Renzo Galanello (2011). a-thalassemia. Genetics in Medicine, 13(2), 83-88.
84. D. J. Weatherall (2001). Phenotype-genotype relationships in monogenic disease: lesson from the thalassemias. Genetics, 2, 56-67.
85. Herbert L. Muncie (2009). Alpha and Beta Thalassemia. American Family Physican, 80(4), 456-462.
86. Rugless M. J. et al. (2008). A large deletion in the human a globin cluster caused by a replication error is associated with an unexpectedly mild phenotype, Hum Mol Genet, 17, 3084-3093.
87. Ngô Diễm Ngọc, Lý thị Thanh Hà, Ngô thị Tuyết Nhung và cộng sự (2015). Chẩn đoán trước sinh bệnh HbH và phù thai do HB Bart’s tại bệnh viện Nhi Trung ương. Tạp chí Y học Việt Nam, 434,115-120.
88. Galanello R., Sollaino C., Paglietti E. et al. (1998). a-thalassemia carrier identification by DNA analysis in the screening of thalassemia. Am JHematol, 59, 273-278.
89. Kanavakis E., Papassotiriou I., Karagiorga M. et al. (2000). Phenotypic and molecular diversity of haemoglobin H disease: a Greek experience. Br J Haematol, 111, 915-923.
90. Harteveld C. L., Yavarian M., Zorai A. et al. (2003). Molecular spectrum of alpha-thalassemia in the Iranian population of Hormozgan: three novel point mutation defects. Am J Hematol, 74, 99-103.
91. Chui D.H. (2005). Alpha-thalassemia: Hb H disease and Hb Barts hydrops fetalis. Ann N Y AcadSci, 1054, 25-32.
92. Jingzhong L. (2011). A novel large deletion causing Hb Bart’s Hydrop Fetalis in South China, Ann Hematol, 90, 125-126.
91. Thein S. L., Hesketh C., Wallace R. B., Weatherall D. J. (1988). The molecular basis of thalassaemia major and thalassaemia intermedia in Asian Indians: Application to prenatal diagnosis. Brit J of Haematol, 70, 225-231.
92. Wong C., Antonarakis S. E., Goff S. C. et al. (1986). On the origin and spread of P- thalassemia: Recurrent observation of four mutations in different ethnic groups. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 6529-6532.
DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization)
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4
1.1. Bệnh Thalassemia 4
1.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 21
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.1. Đối tượng nghiên cứu 36
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37
2.3. Phương pháp nghiên cứu 37
2.4. Cách thức tiến hành nghiên cứu 39
2.5. Hạn chế sai số trong nghiên cứu 47
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu 47
2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 47
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48
3.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 48
3.2. Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng phương pháp Reverse
hybridization 49
3.3. Đánh giá giá trị của phương pháp 56
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 65
4.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 65
4.2. Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse
hybridization và tỷ lệ các loại đột biến 70
4.3. Đánh giá giá trị kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh
bệnh Thalassemia 76
KẾT LUẬN 82
KIẾN NGHỊ 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
NST Nhiễm sắc thể
DNA Deoxyribo Nucleotid Acid
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)
SEA South East Asia
THAI Thailand
FIL Filipino
MED Mediterranean
Hb Hemoglobin (Huyết sắc tố)
A alpha
B beta
HBA Hemoglobin alpha
HBB Hemoglobin beta
ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation System Polymera Chain Reaction
MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
NOR Normal (Bình thường)
HET Heterozygous (Dị hợp tử)
HOM Homozygous (Đồng hợp tử)
ĐCTN Đình chỉ thai nghén
MCV Thể tích trung bình hồng cầu
MCH Lượng hemoglobin trung bình hồng cầu
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ
Bảng 1.1. Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình
thường 5
Bảng 1.2. Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường 11
Bảng 1.3. Kiểu gen và các thể bệnh a-thalassemia 13
Bảng 1.4. Các đột biến gây bệnh P-thalassemia thường gặp ở người Việt Nam . 18 Bảng 1.5. Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gap-
PCR 23
Bảng 1.6. Các đột biến gen P globin và mồi đặc hiệu 26
Bảng 1.7. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng P-Globin
StripAssaySEA 30
Bảng 1.8. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng a-Globin StripAssay .. 31
Bảng 2.1. Các chỉ số nghiên cứu 38
Bảng 2.2. Chỉ dẫn cách đánh giá đột biến trên Teststrip 44
Bảng 2.3. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen a globin 46
Bảng 2.4. Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen P globin 46
Bảng 3.1. Đặc điểm về dân tộc của thai phụ 48
Bảng 3.2. T uổi thai ở thời điểm chọc hút dịch ối của đối tượng nghiên cứu … 48
Bảng 3.3. Tiền sử đẻ con Thalassemia 48
Bảng 3.4. Tiền sử phù thai 49
Bảng 3.5. Tỷ lệ phát hiện đột biến 49
Bảng 3.6. Phân bố loại đột biến 50
Bảng 3.7. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh a -thalassemia 51
Bảng 3.8. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh P-thalassemia 52
Bảng 3.9. Kiểu gen các thai được chẩn đoán trước sinh bệnh a-
thalassemia 53
Bảng 3.10. Kiểu gen các trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh P-
thalassemia 53
Bảng 3.11. Kết quả chẩn đoán trước sinh cho 11 gia đình có con đầu mắc
HbH hoặc P-thalassemia thể nặng 54
Bảng 3.12. Đối chiếu kết quả về phân bố kiểu gen của thai từ 2 phương
pháp ARMS-PCR/gap-PCR và Reverse hybridization 56
Bảng 3.13. Đối chiếu về kết quả xác định các dạng đột biến cụ thể 56
Bảng 3.14. So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc a-
thalassemia) 58
Bảng 3.15. So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc P-
thalassemia) 59
Bảng 4.1. So sánh đặc diểm của 2 phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR
và Reverse hybridization trong chẩn đoán Thalassemia 79
Biểu đồ 3.1. Các loại đột biến gây bệnh a-thalassemia 50
Biểu đồ 3.2. Các loại đột biến gây bệnh P-thalassemia 51
DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ
Hình 1.1. Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb …. 5
Hình 1.2. Vị trí gen a globin trên NST 16 6
Hình 1.3. Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen a 7
Hình 1.4. Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen a 9
Hình 1.5. Một số đột biến mất đoạn trên gen a globin 10
Hình 1.6. Vị trí gen P globin trên NST 11 14
Hình 1.7. Năm đột biến xẩy ra (đóng khung) ở vị trí đầu của intron thứ
nhất của gen p globin 17
Hình 1.8. Chẩn đoán đột biến mất đoạn a+-thalassemia bằng multiplex
gap-PCR 24
Hình 1.9. Chẩn đoán đột biến mất đoạn a0-thalassemia bằng multiplex
gap-PCR 24
Hình 1.10. Chẩn đoán P-thalassemia bằng ARMS-PCR 25
Hình 1.11. Các vị trí đột biến trên Teststrip của P-Globin StripAssay SEA 32
Hình 1.12. Các vị trí đột biến trên Teststrip của a-Globin StripAssay 33
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu 39
Hình 2.2. Cách xác định đột biến trên Teststrip 45
Hình 3.1. Đồng hợp tử đột biến –SEA 60
Hình 3.2. Dị hợp tử đột biến –SEA 61
Hình 3.3. Không phát hiện đột biến gen 62
Hình 3.4. Dị hợp tử đột biến CD17 63
Hình 3.5. Dị hợp tử đột biến kép CD41/42 / HbE 64
Hình 4.1. Sơ đồ sàng lọc trước sinh bệnh Thalassemia 68
Hình 4.2. Sơ đồ xác định loại Thalassemia bằng xét nghiệm huyết học và sinh hóa