Chẩn đoán trước sinh một người mẹ mang gen Dystrophin có nguy cơ sinh con bị bệnh

 

 

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy, DMD) là một trong những bệnh lý thần kinh cơ do di truyền thường gặp nhất ở Việt Nam cũng như ở các nước khác trên thế giới, tần suất mắc bệnh: 1/3500 trẻ trai. Bệnh gây nên do đột biến gen dystrophin (nằm trên nhiễm sắc thể X) đưa đến sự bất thường trong quá trình tổng hợp protein  dystrophin  [2].  Gen  dystrophin  là  một trong những gen lớn nhất của cơ thể với cấu trúc gồm 79 exon, dạng đột biến thường gặp nhất là đột biến mất đoạn, chiếm 60 – 65% [1]. Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân DMD là do nhận gen đột biến di truyền từ người mẹ dị hợp tử, chỉ 1/3 bệnh nhân là do đột biến mới phát sinh [3]. Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường và ngăn chặn bệnh bằng phương pháp phá thai chủ động là một giải pháp hiệu quả nhất để làm giảm tỷ lệ mắc bệnh. Mục tiêu:

 

Chẩn đoán trước sinh nhân một người mẹ dị hợp tử có nguy cơ cao sinh con bị bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne.

 

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

 

1. Đối tượng nghiên cứu

 

– Nhóm đối chứng: 2 người nam và 2 người nữ hoàn toàn bình thường.

 

– Nhóm nghiên cứu: Một người mẹ mang thai có con trai bị mắc bệnh DMD. Con trai của bà đã được chẩn đoán là có đột biến mất đoạn gen từ exon 3 – 8. Người mẹ này được xác định là người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật multiplex PCR định lượng.

 

2. Phương pháp nghiên cứu

 

Phương pháp RT – PCR xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin

 

Tách chiết RNA tổng số của bệnh nhân từ bạch cầu máu ngoại vi và tổng hợp cDNA. Sử dụng 15 cặp mồi thực hiện phản ứng nested PCR để khuếch đại toàn bộ chiều dài gen dystrophin. Sản phẩm PCR lần 2 được điện di trên agarose, so sánh mẫu bệnh nhân và đối chứng, khi vạch điện di của bệnh nhân có kích thước nhỏ hơn mẫu đối chứng là bệnh nhân bị đột biến mất đoạn gen. Tiến hành giải trình tự đoạn gen của bệnh nhân để xác định vị trí exon bị đột biến.

 

Kỹ thuật multiplex PCR định lượng  xác định người lành mang gen bệnh

 

Dựa trên kết quả xác định đột biến của người con trai, chúng tôi sẽ lựa chọn 4 exon, trong đó 2 exon không bị đột biến làm đối chứng nội và 2 exon bị đột biến để xác định khả năng mang gen bệnh. Bốn exon sẽ được khuếch đại với cùng nồng độ và chu trình phản ứng PCR ở mẫu DNA của bệnh nhân, mẹ và chị gái.

 

Kỹ thuật chọc hút dịch ối

 

Thực hiện vào tuần thứ 14 của thai kỳ dưới sự hướng dẫn của siêu âm, kỹ thuật được tiến hành tại Bệnh viện Phụ sản Trung Ương.

 

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối

 

Nuôi cấy tế bào dịch ối ngoài mục đích làm tăng số lượng mẫu, nó còn giúp loại bỏ các tế bào máu mẹ lẫn vào mẫu bệnh phẩm. Sử dụng môi trường Amniomax để tạo các tế bào sợi bám dính vào mặt bình nuôi cấy. Nuôi cấy theo phương pháp hở tủ ấm 370C với 5% CO2 và 95% không khí cùng nguồn ẩm. Thời gian trung bình nuôi cấy là từ 7 – 15 ngày.

 

Các tế bào ối thai nhi thu được với số lượng tương đối sau khi nuôi cấy được tách DNA theo phương pháp phenol – chloroform và sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích gen.