Chẩn đoán xác định các bệnh nhân hôi chứng Turner khám 45,X/46,XY bằng kỹ thuật di truyền tế bào và phân tử

Hội chứng Turner khảm 45,X/46,XY rất hiếm gặp và th-ờng khó chăn đoán nếu chỉ áp dụng kỹ thuật di truyền tế bào. Muc tiêu: Ap dụng kỹ thuật di truyền tế bào và di truyền phân tử đê phát hiện NST Y ở những bệnh nhân (BN) hội chứng Turner khảm 45,X/46,XY. Đôi t-ơng và ph-ơng pháp: Ap dụng kỹ thuật di truyền tế bào (phân tích NST và vật thê Barr) và kỹ thuật di truyền phân tử (phản ứng multiplex PCR) đê chăn đoán xác định 3 BN hội chứng Turner nghi ngờ khảm 45,X/46,XY. Kết quả: BN số 1 đã đ-Ợc chăn đoán xác định chỉ áp dụng kỹ thuật di truyền tế bào: karyotyp 45,X (86%)/46,XY (14%), vật thê Barr (-); BN số2 và 3 đã phải phối hỢp cả kỹ thuật di truyền tế bào và phân tử. Di truyền tế bào: vật thê Barr (-) ở cả 2 BN; Karyotyp: 45,X (82%)/46,X,+ mar (18%) BN số 2) và 45,X (67%) /46,X,+ mar (33%) (BN số3). Di truyền phân tử: phản ứng PCR cho kết quả TDF (+) ở cả 2 BN. Kết luân: NST “mar” ở hai BN sô’ 2 và 3 chính là NST Y bị biến đôi hình thái.

Hôi chứng Turner (gặp trong quần thể với tỉ lê 1/3000-1/5000 trẻ sơ sinh gái) là loại bênh rối loạn vật chất di truyền do những căn nguyên khác nhau gây nên. Ở giai đoạn phôi thai, tỉ lê các thai hôi chứng Turner bị sẩy tư nhiên tới 99,8% [6], vì thế các bênh nhân hôi chứng Turner sau này chỉ là số’ rất ít còn sống sót. Triệu chứng lâm sàng điển hình nh- sau: ng-ời lùn, cổ ngắn, có nếp da cổ, tóc mọc thấp, giới tính thứ cấp không phát triển, bô phận sinh dục nhi tính, th-ờng không có lông sinh dục, vô kinh hoặc thiểu kinh, vô sinh. Nguyên nhân của hôi chứng Turner chủ yếu là do bô nhiễm sắc thể (NST) thiếu 1 NST X, công thức karyotyp là 45,X (chiếm khoảng 50% tổng số bệnh nhân hôi chứng Turner), số còn lại là các thể bệnh khảm (trong cơ thể có đồng thời hai hay nhiều dòng tế bào trong đó có dòng tế bào 45,X). Trong số bệnh nhân thể khảm có loại rất hiếm gặp (chiếm tỉ lệ 5% tổng số bệnh nhân hôi chứng Turner) bao gồm dòng tế bào 45,X với dòng tế bào 46 NST trong đó có chứa NST Y hoặc có NST chứa gen TDF đặc hiệu của NST Y [1], [7]. Các tr-ờng hợp khảm này bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng rất đa dạng: cơ quan sinh dục ngoài hoặc tuyến sinh dục có thể biểu hiện là nam, hoặc mơ hồ giới tính, hoặc biểu hiện hoàn toàn là nữ. ở các bệnh nhân này có nguy cơ cao u nguyên bào sinh dục, vì thế điều quan trọng là cần xác định đ-ợc dòng tế bào có NST Y từ đó có thể khuyên bệnh nhân nên phẫu thuật loại bỏ tuyến sinh dục, phòng biến chứng u nguyên bào sinh dục [7]. Với những bệnh nhân hôi chứng Turner khảm có dòng tế bào chứa NST Y rõ, có thể chẩn đoán chỉ đơn thuần bằng kỹ thuật di truyền tế bào tức là dùng kỹ thuật phân tích vật thể Barr phối hợp với kỹ thuật phân tích NST đ-ợc nhuộm băng (th-ờng dùng băng G) qua nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi. Các tr-ờng hợp bệnh nhân hôi chứng Turner khảm dòng tế bào 45,X với dòng tế bào 46 NST trong đó có 1 NST bất th-ờng có kích th-ớc hoặc nhỏ hơn hoặc to hơn kích th-ớc của NST Y, hình ảnh băng đặc hiệu của NST Y không rõ nên đ-ợc gọi là NST marker và rất khó khăn trong chẩn đoán nếu chỉ dùng xét nghiệm di truyền tế bào. Đối với các bệnh nhân này, ngoài kỹ thuật di truyền tế bào cần phải có xét nghiệm phân tử kết hợp để chẩn đoán nh- dùng ADN dò đặc hiệu của NST Y trong các kỹ thuật lai axit nucleic nh- kỹ thuật FISH, kỹ thuật Southern blot, hoặc dùng kỹ thuật multiplex PCR (multiplex polymerase chain reaction) để phát hiện gen TDF trong NST marker. Gen TDF (Testis Determining Factor) là gen biệt hoá tinh hoàn xác định giới tính nam nằm trên vùng biệt hoá giới tính SRY (Sex determining region Y) thuộc nhánh ngắn NSTY (Yp11.3). Xuất phát từ đặc điểm phức tạp về bênh nguyên và bênh sinh của bênh nhân hội chứng Turner có NST Y, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài “Chẩn đoán xác định các bệnh nhân hôi chứng Turner khám 45,X/46,XY bằng kỹ thuật di truyền tế bào và phân tử’ với mục tiêu:
Áp dụng kỹ thuật di truyền tế bào (phân tích NST, vật thểBarr) và di truyền phân tử (PCR) để phát hiện NST Y ở nhũng bệnh nhân hôi chứng Turner khám 45,X/46,XY.
Với đề tài này, chúng tôi mong muốn góp phần giúp cho các bác sĩ di truyền và lâm sàng có h-ớng đúng để xác định căn nguyên từ đó có chỉ định điều trị đúng cho các bênh nhân hội chứng Turner có NST Y.
II.    ĐỐI T-ỢNG VÀ PH-ƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.    Đối t-ợng nghiên cứu: Đối t-ơng nghiên cứu là 3 bênh nhân nữ trên lâm sàng đ-ơc chẩn đoán sơ bộ là hội chứng Turner. Các bênh nhân này đ-ơc các bác sĩ lâm sàng từ các địa chỉ sau gửi đến phòng xét nghiêm di truyền bộ môn Y Sinh học – Di truyền, tr-ờng Đại học Y Hà Nội: Khoa nội tiết bênh viên nhi và Bênh viên phụ sản với các triệu chứng dây thì muộn, vô kinh nguyên phát, trên lâm sàng có biểu hiên triêu chứng của hội chứng Turner.
2.2.    Ph-ơng pháp nghiên cứu
Sử dụng ph-ơng pháp nghiên cứu mô tả. Các bênh nhân đ-ơc thăm khám lâm sàng, làm bênh án di truyền, xây dựng phả hê, phân tích nếp vân da và xét nghiêm di truyền tế bào bao gồm xét nghiêm NST và vật thể Barr và xét nghiêm di truyền phân tử (áp dụng kỹ thuật multiplex PCR (multiplex poly- merase chain reaction).
Làm bệnh án di truyền: khai thác các yếu tố thuộc về bênh nhân: tuổi, giới, các biểu hiên lâm sàng của dị tật, đặc điểm nếp vân da.
Lập phả hệ: Sử dụng các ký hiêu quốc tế để xây dựng phả hê của các bênh nhân.
Phân tích nếp vân da: Nếp vân da đ-ơc phân tích chủ yếu là các nếp của lòng bàn tay bao gồm nếp dọc, nếp ngang gần và nếp ngang xa.
Xét nghiệm di truyền tế bào:
Xét nghiêm NST
–    Nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi để phân tích NST. Tiêu bản NST đ-ơc nhuộm bằng hai ph-ơng pháp: nhuộm giêmsa thông th-ờng và nhuộm băng G.
–    NST đ-ơc phân tích trên kính hiển vi có độ phóng đại x 1000 lần theo tiêu chuẩn của hội nghị quốc tế về di truyền ng-ời ISCN (1995).
Xét nghiêm vật thể Barr
–    Kỹ thuật xét nghiêm vật thể Barr đ-ơc áp dụng ph-ơng pháp phân tích vật thể giới ở nhân tế bào gian kỳ của Schwarzacher H.G.
–     Tế bào đ-ơc xét nghiêm là tế bào niêm mạc miêng, mặt trong má, đ-ơc nhuộm bằng Xanh tolu- idin, phân tích vật thể Barr ở vật kính có độ phóng đại x1000.
Xét nghiêm di truyền phân tử: áp dụng kỹ thuật multiplex PCR (multiplex polymerase chain reaction) với hai cặp mồi: cặp thứ nhất: TDF1, TDF2; cặp thứ 2: DQa1, DQa2.
Kỹ thuật tách chiết ADN: tách chiết ADN từ máu ngoại vi đ-ơc chống đông bằng EDTA [4], ADN thu đ-ơc dùng để thực hiên phản ứng multiplex PCR. Phản ứng multiplex PCR (multiplex polymerase chain reaction) đ-ơc thực hiên với hai cặp mồi [3]:
1.    Cặp mồi thứ nhất: TDF1, TDF2: mỗi mồi gồm 20 cặp nucleotid, khuyếch đại đoạn ADN thu đ-ơc sản phẩm 139 cặp bazơ nitơ ở trên gen biêt hoá tinh hoàn TDF có ở vùng SRY, gen này chỉ có ở ng-ời nam, có vai trò quan trọng trong viêc hình thành giới tính nam.
2.    Cặp mồi thứ 2 DQa (DQax, DQa2): mỗi mồi gồm 26 cặp nucleotid, khuyếch đại đoạn ADN gồm 239 hoặc 242 cặp bazơ nitơ thuộc gen ở vùng HLA- DQa (Human leucocyte antigen – DQa). Gen này nằm trên NST số 6 có ở tất cả mọi ng-ời nam, nữ.
Điên di ADN và phân tích kết quả điên di nh- sau:
Kết quả TDF d-ơng tính: Mau có 2 băng ADN: băng ADN thứ nhất gồm 239/242 cặp bazơ nitơ đặc hiêu cho HLA – DQa và băng ADN thứ hai gồm 139 cặp bazơnitơ đặc hiêu cho SRY; gen biêt hóa tinh