CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP THÀNH PHỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Y TẾ – BẢO HỘ LAO ĐỘNG-VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP THÀNH PHỐ NGHIÊN CỨU  ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Y TẾ – BẢO HỘ LAO ĐỘNG-VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM.Nhiễm nấm là một trong những bệnh khá phổ biến trên thế giới. Nấm tồn tại mọi nơi trên cả cơ thể người và động vật, phát triển và gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Tại Mỹ, tỷ lệ tử vong do nấm đứng hàng thứ 10 trong các nguyên nhân tử vong từ các bệnh nhiễm trùng, đến 1997 tỷ lệ này tăng gấp 3 lần, đứng hàng thứ 4. Tại Pháp, trong 10 năm gần đây (2001-2010) ước tính khoảng 36000 người nhiễm nấm, trong đó 28% trường hợp tử vong do bệnh nấm [1]. 
    Tại bệnh viện Da liễu Trung Ương, số bệnh nhân đến khám và làm xét nghiệm tìm nấm rất đông và đa dạng. Trong đó, vi nấm Malassezia spp. gây bệnh ngoài da chiếm tỷ lệ khá cao. Malassezia có 14 loài, mỗi loài có độc tính khác nhau nên khả năng gây bệnh đa dạng: Lang ben, viêm da dầu, viêm da cơ địa, viêm nang lông,…. Bệnh biểu hiện các triệu chứng lâm sàng như: Ngứa, đỏ da, bong vẩy,…Thương tổn có thể gặp bất kỳ vùng nào trên cơ thể nhưng thông thường khu trú vùng tiết nhiều bã nhờn như: da đầu, lưng, ngực, mặt. Ngoài ra, có thể gặp ở nếp kẽ, nang lông, vùng móng…thậm chí vi nấm xâm nhập các cơ quan, bộ phận gây nhiễm nấm nội tạng, nhiễm nấm huyết. Do đó, nếu thiếu điều kiện xét nghiệm dễ dẫn đến chẩn đoán nhầm hoặc bỏ qua. Bệnh da do nhiễm Malassezia spp. không tử vong, nhưng gây nhiều phiền toái ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân, đặc biệt nếu không điều trị đúng và kịp thời sẽ diễn biến dai dẳng, tiến triển nặng nề. 

    Thực tế, việc xác định nấm bằng phương pháp trực tiếp là bước chẩn đoán sơ bộ quan trọng giúp các bác sỹ đối chiếu với đặc điểm lâm sàng để quyết định điều trị ngay khi chưa có điều kiện làm kháng nấm đồ. Sự tồn tại song song vi nấm men này trên da người khỏe mạnh và da người bệnh đặt ra nhiều giả thuyết khác nhau về đặc tính sinh bệnh học của loài này. Một số tác giả cho rằng, sự xuất hiện của vi nấm trong một số bệnh da không phải tác nhân gây bệnh tiên phát mà chỉ bội nhiễm thứ phát. Các nghiên cứu được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới, nhưng cơ chế gây bệnh của vi nấm vẫn chưa thực sự rõ ràng. Những hiểu biết hiện tại cho thấy khả năng gây bệnh của vi nấm không chỉ dừng lại ở việc chuyển từ dạng men sang dạng sợi như một số loài nấm khác (Candida…) mà chính là do sự tồn tại một lượng lớn nấm men trên da thúc đẩy quá trình khởi phát bệnh khi có điều kiện thuận lợi. Tuy nhiên, kiến thức về nấm Malassezia chưa phổ biến ở Việt Nam, cho nên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát triển và ứng dụng một số kỹ thuật xác định chủng Malassezia gây bệnh Lang ben nhằm mục tiêu: 
1.    Đánh giá đặc điểm phân bố các chủng vi nấm Malassezia gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện tại khu vực Hà Nội.
2.    Đánh giá đặc điểm phân bố các chủng vi nấm Malassezia trên da người khỏe mạnh.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU    1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN    3
1.1. Nấm Malassezia    3
1.1.1. Vài nét lịch sử    3
1.1.2. Đặc điểm nấm Malassezia    3
1.1.3. Cơ chế gây bệnh    4
1.1.4. Một số yếu tố thuận lợi    5
1.1.5. Lang ben và một số bệnh lý khác do Malassezia    6
1.2. Bệnh lang ben    9
1.2.1. Dịch tễ    9
1.2.2. Căn nguyên    11
1.2.3. Đặc điểm lâm sàng    12
1.2.4. Cận lâm sàng    15
1.2.5. Chẩn đoán xác định    15
1.2.6. Chẩn đoán phân biệt    16
1.2.7. Điều trị    17
1.3. Các phương pháp chẩn đoán Malassezia trong bệnh lang ben    19
1.3.1. Phương pháp xét nghiệm trực tiếp    19
1.3.2. Nuôi cấy định danh    25
1.3.3. Sinh học phân tử    30
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU    33
2.1. Xác định các chủng Malassezia gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội    33
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu    33
2.1.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu    33
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu    34
2.1.4. Quy trình nghiên cứu    36
2.2. Nghiên cứu xác định các chủng Malassezia trên người khoẻ mạnh    36
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu    36
2.2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu    36
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu    36
2.2.4. Quy trình nghiên cứu    38
2.3. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả kỹ thuật lấy bệnh phẩm tìm Malassezia bằng băng dính    38
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu    38
2.3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu    38
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu    38
2.3.4. Quy trình nghiên cứu    40
2.4. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink    40
2.4.1. Đối tượng nghiên cứu    40
2.4.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu    40
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu    40
2.4.4. Quy trình nghiên cứu    42
2.5. Xây dựng tiêu chuẩn và một số quy trình xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia spp. trong chẩn đoán bệnh lang ben    42
2.5.1. Đối tượng nghiên cứu    42
2.5.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu    42
2.5.3. Phương pháp nghiên cứu    43
2.6. Xây dựng quy trình và tiêu chuẩn xét nghiệm chẩn đoán nguyên nhân bệnh lang ben    44
2.6.1. Quy trình soi trực tiếp bằng phương pháp băng dính và NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink     44
2.6.2. Quy trình nuôi cấy định danh    45
2.6.3. Quy trình PCR sequencing    50
2.7. Quản lý và phân tích số liệu    51
2.7.1. Quản lý số liệu    51
2.7.2. Phân tích số liệu    52
2.8. Đạo đức trong nghiên cứu    52
2.9. Hạn chế của đề tài    52
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU    53
3.1. Xác định các chủng Malassezia gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội    53
3.1.1. Xác định Malassezia trong bệnh lang ben bằng nuôi cấy và PCR sequencing    53
3.1.2. Xác định Malassezia trên người khoẻ mạnh    67
3.1.3. Đánh giá hiệu quả kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng dính    70
3.1.4. Đánh giá hiệu quả kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink    75
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia trong chẩn đoán bệnh lang ben    80
3.2.1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu    80
3.2.2. Kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh    81
3.2.3.Kết quả soi trực tiếp của nhóm chứng    84
3.2.4.So sánh kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh và nhóm chứng    86
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN    87
4.1. Xác định các chủng Malassezia gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội    87
4.1.1. Xác định Malassezia trong bệnh lang ben bằng nuôi cấy và PCR sequencing    87
4.1.2. Xác định Malassezia trên người khoẻ mạnh    102
4.1.3. Đánh giá hiệu quả kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng dính    103
4.1.4. Đánh giá hiệu quả kỹ thuật soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH kết hợp ParkerTM blue black ink    109
4.2. Xây dựng tiêu chuẩn xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia trong chẩn đoán bệnh lang ben    111
4.2.1. Kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh    111
4.2.2. Kết quả soi trực tiếp của nhóm chứng    113
4.2.3. So sánh kết quả soi trực tiếp của nhóm bệnh và nhóm chứng    114
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN    116
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.     So sánh tính hiệu quả giữa 2 kỹ thuật lấy bệnh phẩm bằng băng dính và dao cùn trong xét nghiệm trực tiếp tìm nấm    22
Bảng 1.2.     So sánh soi trực tiếp tìm Malassezia bằng NaOH+BI và KOH    24
Bảng 1.3.     Đặc điểm các môi trường thường dùng trong nuôi cấy Malassezia    26
Bảng 1.4.     Đặc điểm kiểu hình của 14 loài Malassezia  dựa trên đặc tính sinh lý và sinh hóa    27
Bảng 1.5.     Đặc tính các loài Malassezia trên CHROM agar Malassezia    29
Bảng 1.6.     Các phương pháp định danh Malassezia bằng sinh học phân tử và PCR     31
Bảng 3.1. Phân bố đặc trưng cá nhân của bệnh nhân    53
Bảng 3.2. Phân bố bệnh theo địa dư và nghề nghiệp    54
Bảng 3.3. Kết quả nuôi cấy từ vảy da bệnh nhân lang ben    55
Bảng 3.4. Kết quả định danh các loài Malassezia bằng nuôi cấy    55
Bảng 3.5. Kết quả PCR từ vảy da bệnh nhân lang ben    56
Bảng 3.6. Kết quả Malassezia định danh theo PCR sequencing    56
Bảng 3.7. Độ nhạy, độ đặc hiệu của PCR theo nuôi cấy    57
Bảng 3.8. Độ nhạy, độ đặc hiệu của loài M. globosa với kỹ thuật PCR sequencing theo nuôi cấy    58
Bảng 3.9. Phân bố các loài Malassezia gây bệnh lang ben theo nhóm tuổi    59
Bảng 3.10. Phân bố loài Malasssezia gây bệnh lang ben theo giới    60
Bảng 3.11. Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo địa dư    61
Bảng 3.12. Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo thời gian bị bệnh    62
Bảng 3.13. Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo tính chất bệnh    63
Bảng 3.14. Phân bố đặc trưng cá nhân của nhóm người khỏe mạnh tình nguyện    67

Bảng 3.15. Kết quả định danh các loài Malassezia bằng nuôi cấy của người khỏe mạnh tình nguyện    68
Bảng 3.16. Kết quả Malassezia định danh theo PCR sequencing của người khỏe mạnh tình nguyện    69
Bảng 3.17. Phân bố bệnh theo tuổi    70
Bảng 3.18. Phân bố bệnh theo giới    71
Bảng 3.19. Phân bố bệnh theo địa dư    71
Bảng 3.20. Thời gian trả kết quả xét nghiệm của phương pháp băng dính và dao cùn    72
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của phương pháp băng dính và dao cùn theo vị trí    72
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của phương pháp băng dính và dao cùn theo đối tượng    73
Bảng 3.23. Kết quả soi trực tiếp của phương pháp băng dính và dao cùn    73
Bảng 3.24. Ảnh hưởng khi nhận định hình thái trên KHV của phương pháp băng dính và dao cùn    74
Bảng 3.25. Kết quả nhận định tế bào nấm men bằng phương pháp băng dính và dao cùn    74
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của phương pháp băng dính và dao cùn theo thương tổn vảy da    75
Bảng 3.27. Phân bố bệnh theo tuổi    76
Bảng 3.28. Phân bố bệnh theo giới    76
Bảng 3.29. Phân bố bệnh theo địa dư    77
Bảng 3.30. Thời gian trả kết quả xét nghiệm của phương pháp NaOH+BI và KOH    77
Bảng 3.31. Kết quả soi trực tiếp của phương pháp NaOH+BI và KOH    78
Bảng 3.32. Ảnh hưởng khi nhận định hình thái trên kính hiển vi của phương pháp NaOH+BI và KOH    78
Bảng 3.33. Kết quả nhận định tế bào nấm men bằng phương pháp NaOH+BI và KOH    79
Bảng 3.34. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp NaOH+BI theo nuôi cấy    79
Bảng 3.35. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp KOH theo nuôi cấy    80
Bảng 3.36. Đặc điểm nhóm nghiên cứu theo tuổi    80
Bảng 3.37. Đặc điểm nhóm nghiên cứu theo giới    81
Bảng 3.38. Kết quả nuôi cấy định danh từ vảy da    81
Bảng 3.39. Kết quả định lượng tế bào nấm men    82
Bảng 3.40. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kết quả định lượng tế bào nấm men theo nuôi cấy ở nhóm bệnh    83
Bảng 3.41. Kết quả nuôi cấy định danh từ vảy da    84
Bảng 3.42. Kết quả định lượng tế bào nấm men    84
Bảng 3.43. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kết quả định lượng tế bào nấm men theo nuôi cấy ở nhóm bệnh    85
Bảng 3.44. So sánh số lượng vi nấm 20TB/VT ở người bệnh và người lành    86
Bảng 4.1. Xác định Malassezia theo nuôi cấy đinh danh ở các nghiên cứu    92