Đặc điểm dịch tễ học phân tử về gen độc lực, kháng kháng sinh của Enterococcus faecalis phân lập từ người, động vật, thực phẩm, ngoại cảnh
Luận án tiến sĩ y học Đặc điểm dịch tễ học phân tử về gen độc lực, kháng kháng sinh của Enterococcus faecalis phân lập từ người, động vật, thực phẩm, ngoại cảnh.E. faecalislà vi khuẩn phân bố rộng rãi trong môi trường. Chúng có mặt trong nhiều loại thực phẩm lên men như pho mát, xúc xích và rau quả, tham gia vào quá trình chín và tạo hương thơm của những thực phẩm này nhờ hoạt động phân giải protein và lipolytic.1,2 Một số chủng được sử dụng làm men vi sinh cho con người vì chúng có thể tồn tại và cạnh tranh trong đường tiêu hóa, hỗ trợ phân giải thức ăn.3 Trong công nghiệp thực phẩm, E. faecaliscũng được sử dụng như một “chất bảo quản” nhờ khả năng tiết bacteriocin ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây thối rữa khác.4
Vi khuẩn này thuộc vi hệ đường tiêu hóa người và động vật, từng được cho là vô hại và không có vai trò quan trọng trong y học. Tuy nhiên, cho đến nay, E. faecalisđã nổi lên với tư cách như một tác nhân quan trọng gây ra viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng sau phẫu thuật và liên quan đến các thiết bị y tế nhiễm bẩn.5-8 Đây là vi khuẩn Gram dương hàng đầu phân lập được từ nhiễm trùng đường tiết niệu tại Việt Nam,9,10 là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện đứng thứ ba, chiếm 14% ở Hoa Kỳ từ năm 2011 đến 2014.5 Việc sở hữu nhiều gen độc lực giải thích cho sự thường gặp nhất của loài vi khuẩn này trong số các Enterococcusphân lập được trên lâm sàng.11-14
Bên cạnh đó, sự đề kháng kháng sinh của E. faecaliscó xu hướng gia tăng. Ngoài sự đề kháng tự nhiên với 1 số nhóm kháng sinh như aminogycosid (mức độ thấp), cephalosporins, sulphonamides, clindamycin và quinupristin/dalfopristin, loại vi khuẩn này còn có thể thu nhận các gen đề kháng thông qua áp lực chọn lọc của kháng sinh (gyrA, parC kháng quinolone, vanA, vanB kháng vancomycin, …) hoặc các yếu tố di truyền động plasmid, transposone (ermA, ermB kháng macrolide, otrpA, poxA kháng linezolid.). Sự xuất hiện đề kháng không chỉ diễn ra trong môi trường bệnh viện mà ngay cả đối với cộng đồng, đặc biệt ở các trang trại chăn nuôi có sử dụng kháng sinh. Đáng lo ngại, vi khuẩn có thể đề kháng với các kháng sinh quan trọng dùng để điều trị các nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương như vancomycin, linezolid. Điển hình là sự bùng nổ Enterococcus kháng vancomycin (VRE) khi sử dụng avoparcin15 hoặc gần đây, kháng linezolid liên quan đến sử dụng phenicol, macrolide trong chăn nuôi đã được đề cập đến.16,17E. faecaliskháng kháng sinh từ động vật được đào thải ra ngoại cảnh, gây ô nhiễm thực phẩm và lây lan sang người. Có thể nói, phát sinh vi khuẩn kháng kháng sinh từ các trang trại chăn nuôi là nhân tố quan trọng góp phần làm cho tình hình đề kháng kháng sinh trở nên phức tạp hơn.
Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về sự có mặt của E. faecalistrong môi trường trang trại cũng như các đặc điểm phân tử liên quan đến độc lực và khả năng kháng kháng sinh của loài vi khuẩn này. Ngoài ra, sự lây lan của các chủng đề kháng trong cộng đồng cũng ít được đề cập. Chính vì vậy, hiểu biết về sự có mặt của E. faecalisở đường tiêu hóa người, động vật, ở thực phẩm, môi trường; chứng minh sự tồn tại gen độc lực, gen kháng kháng sinh, cung cấp bằng chứng ở cấp độ phân tử về sự lan truyền là cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp toàn diện nhằm hạn chế vi khuẩn kháng kháng sinh, đặc biệt trong bối cảnh ‘One health’ được đề xuất như một giải pháp tích cực hiện nay. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đặc điểm dịch tễ học phân tử về gen độc lực, kháng kháng sinh của Enterococcus faecalisphân lập từ người, động vật, thực phẩm, ngoại cảnh” với 3 mục tiêu:
1. Mô tả đặc điểm dịch tễ học Enterococcus faecalisphân lập được từ người, động vật, thực phẩm, ngoại cảnh
2. Xác định một số gen độc lực, gen kháng kháng sinh của các chủng Enterococcus faecalis
3. Đánh giá mối liên hệ kiểu gen của Enterococcus faecalisphân lập từ người, động vật, thực phẩm, ngoại cảnh.
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 3
TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về E. faecalis 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học của E. faecalis 3
1.1.2. Khả năng gây bệnh 15
1.1.3. Phân bố của Enterococcus 20
1.1.4. Các cơ chế kháng kháng sinh của Enterococcus faecalis 25
1.1.5. Tiếp cận một sức khỏe 35
1.2. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, gen đề kháng và mối liên hệ
kiểu gen giữa các chủng 36
1.2.1. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh 36
1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện gen kháng kháng sinh 42
1.2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng vi
khuẩn 48
1.3. Tính thời sự, tính mới của nghiên cứu 53
1.3.1. Tính thời sự 53
1.3.2. Tính mới 54
Chương 2 55
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55
2.1. Địa điểm nghiên cứu 55
2.1.1. Địa điểm lấy mẫu 55
2.1.2. Địa điểm thực hiện các xét nghiệm phân tích vi sinh 55
2.2. Thiết kế nghiên cứu 55
2.3. Thời gian nghiên cứu 55
2.4. Đối tượng nghiên cứu 55
2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu 57
2.6. Phương pháp và phương tiện nghiên cứu 57
2.6.1. Phương pháp lựa chọn mẫu 58
2.6.2. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm 58
2.6.3. Nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn 60
2.6.4. Kháng sinh đồ với các vi khuẩn E. faecalis 60
2.6.5. PCR phát hiện các gen liên quan tới độc lực và kháng kháng sinh 62
2.6.6. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE 65
2.6.7. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen Whole genome sequencing (WGS) 66
2.7. Các chỉ số, biến số nghiên cứu 69
2.8. Thu thập và phân tích số liệu 71
2.9. Khống chế sai số 72
2.10. Đạo đức nghiên cứu 72
2.11. Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu 73
Chương 3 74
KẾT QUẢ 74
3.1. Đặc điểm dịch tễ học của E. faecalis 74
3.1.1. Tỷ lệ E. faecalisphân lập được trong nghiên cứu 74
3.1.2. Mức độ nhạy cảm của E. faecalisvới các loại kháng sinh 74
3.2. Gen liên quan tới độc lực và gen kháng kháng sinh của các chủng E.faecalis 78
3.2.1. Gen độc lực 78
3.2.2. Các gen độc lực trong các chủng E. faecalistừ các nguồn khác nhau 78
3.2.2. Gen liên quan đến kháng kháng sinh 79
3.2.3. Tỷ lệ gen kháng kháng sinh trong các chủng E. faecalisđề kháng theo
nguồn gốc phân lập được 81
3.3. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. faecalisbằng kỹ thuật PFGE 88
3.4. Đặc điểm sinh học phân tử các chủng giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) 93
3.4.1. Kiểu ST của các chủng E. faecalis 93
3.4.2. Các gen độc lực 96
3.4.3. Các gen kháng kháng sinh 97
3.4.4. Các loại plasmid trong các chủng E. faecalis 103
3.4.5. Mối liên hệ kiểu gen của các chủng mang optrA 104
Chương 4 111
BÀN LUẬN 111
4.1. Đặc điểm dịch tễ học của E. faecalis 111
4.1.1. Tỷ lệ phân lập E. faecalis 111
4.1.2. Mức độ nhạy cảm của E. faecalisvới các loại kháng sinh 115
4.2. Các gen độc lực và gen liên quan đến kháng kháng sinh của E. faecalis 127
4.2.1. Các gen độc lực 127
4.2.2 Các gen liên quan đến kháng kháng sinh 142
4.2.3. Các plasmid trong E. faecalis 163
4.3. Mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. faecalis 167
4.3.1. Mối liên hệ kiểu gen xác định bằng kỹ thuật PFGE 167
4.3.2. Mối liên hệ kiểu gen xác định bằng kỹ thuật MLST và WGS 170
4.5. Hạn chế của nghiên cứu 173
KẾT LUẬN 174
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
KHUYẾN NGHỊ
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ.NGHIÊN CỨU
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Cấu trúc vách E. faecalis 3
Hình 1. 2. Quá trình tổng hợp vách tế bào E. faecalis 3
Hình 1. 3. Mô hình cho cơ chế kích hoạt fsr trong E. faecalisvà tác dụng của nó đối với sự tổng hợp gelatinase và serine protease 10
Hình 1. 4. Cấu trúc Esp của E. faecalis 11
Hình 1. 5. Cấu trúc Ace của E. faecalis 13
Hình 1. 6. Cấu trúc các operon van 27
Hình 1. 7. Phương pháp pha loãng trong thạch 40
Hình 3. 1. Hình ảnh đại diện kết quả điện di xung trường của đại diện 88
Hình 3. 2. Mối liên hệ kiểu gen của các chủng E. faecalis 89
Hình 3. 3. Mối liên hệ kiểu gen giữa các sequence type xác định được ở các chủng trong
nghiên cứu và trên thế giới 95
Hình 3. 4. Mối liên hệ ST giữa các chủng và kiểu gen độc lực 96
Hình 3. 5. Mối liên hệ ST giữa các chủng và kiểu gen liên quan kháng kháng sinh 98
Hình 3. 6. Phylogenetic các chủng mang optrA dựa trên sự khác biệt SNP 105
Hình 3. 7. Genetic context của optrA trên chromosome 106
Hình 3. 8. Genetic optrA trên Tn6647 và các chủng so sánh 107
Hình 3. 9. Genetic context optrA trên plasmid 108
Hình 3. 10. Genetic optrA chứa trình tự chèn IS và các chủng so sánh 109
Hình 3. 11. Genetic context optrA chưa xác định vị trí 110
DANH MỤC BANG
Bảng 1. 1. Tính chất sinh vật hóa học của E. faecalis 7
Bảng 2. 1. Loại mẫu và số lượng mẫu thu thập được 57
Bảng 2. 2. Trình tự prime phát hiện gen liên quan tới độc lực 62
Bảng 2. 3. Trình tự prime phát hiện gen liên quan tới sự đề kháng kháng sinh 63
Bảng 3. 1. Liên quan giữa kiểu hình kháng linezolid và các kháng sinh khác 75
Bảng 3. 2. Tỷ lệ đề kháng với các loại kháng sinh của các chủng E. faecalisphân lập từ các nguồn 77
Bảng 3. 3. Tỷ lệ các gen độc lực phân lập được từ các nguồn 78
Bảng 3. 4. Tỷ lệ mang gen đề kháng kháng sinh trên các chủng E. faecalis 79
Bảng 3. 5. Liên quan giữa kiểu hình và kiểu gen kháng linezolid 80
Bảng 3. 6. Sự phân bố gen optrA, gyrA và vanC trong các nguồn 81
Bảng 3. 7. Tỷ lệ các gen kháng kháng sinh trên các chủng đề kháng theo nguồn 82
Bảng 3. 8. Phân bố gen optrA trên các chủng E. faecaliskháng kháng sinh 84
Bảng 3. 9. Kiểu hình kháng kháng sinh của các các chủng E. faecalis 85
Bảng 3. 10. Phân bố kiểu sequence type của 47 chủng E. faecalis 94
Bảng 3. 11. Các biến thể optrA và vị trí acid nucleic đột biến 100
Bảng 3. 12. Liên quan các đột biến gen gyrA, parC và giá trị MIC của ciprofloxacin, levofloxacin 101
Bảng 3. 13. Liên quan các biến thể optrA và giá trị MIC của linezolid 102
Bảng 3. 14. Liên quan giá trị MIC của vancomycin và sự có mặt của operon vanC ….102
Bảng 3. 15. Số lượng và loại plasmid có trong các chủng E. faecalis 103
Nguồn: https://luanvanyhoc.com