Đặc điểm đột biến gen Rpob của một số chủng vi khuẩn Lao kháng Rifampicin phân lập tại Việt Nam

Vi khuẩn lao hiện đang lây nhiễm cho 1/3 dân số thế giới. WHO nhận định rằng bệnh lao đang quay trở lại và trở nên tồi tệ hơn với đặc trưng là kháng đa thuốc của vi khuẩn lao [10]. Để công tác điều trị đạt hiệu quả cao, đồng thời kiểm soát được các chủng lao kháng thuốc thì chẩn đoán sớm mắc lao và phát hiện nhanh tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là những yêu cầu cơ bản nhất [9].
Người ta đã xác định rằng kháng rifampicin là chỉ điểm của kháng đa thuốc. Kháng đa thuốc được định nghĩa là kháng với ít nhất đồng thời rifampicin và isoniazid. Kháng RIF có tới 95% là đồng kháng với isoniazid. Do vậy, chỉ cần xác định chủng vi khuẩn lao kháng RIF đồng nghĩa với xác định kháng đa thuốc của chủng vi khuẩn lao đó. Tính kháng RIF có liên quan chặt chẽ với vùng hay xảy ra đột biến gồm 81 bp của gen rpoB. Gen này mã hoá các amino acid cấu tạo nên tiểu phần ß của RNA polymerase, là men có tác dụng xúc tác tổng hợp mRNA. Bình thường RIF bám vào tiểu phần ß và gây ức chế phiên mã
di truyền. Sự đột biến ở đoạn gen rpoB làm thay đổi cấu trúc tiểu phần ß của enzym RNA polymerase và do đó làm giảm độ bám của rifampicin với enzym này. Như thế đột biến gen rpoB gây ức chế tác dụng của RIF. Và xác định đột biến trên gen này đồng nghĩa với việc chẩn đoán vi khuẩn lao kháng rifampicin [6].
Việc ứng dụng sinh học phân tử vào chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc sẽ rút ngắn thời gian từ 2 – 4 tháng như kinh điển xuống còn khoảng 4 ngày sẽ mang lại hiệu quả rất lớn trong kiểm soát bệnh lao và cũng giúp ích cho nghiên cứu tạo ra các thuốc chống lao mới, hiệu quả hơn. Hiện nay việc ứng dụng này ở Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu:
Xác định tần suất, đặc điểm của đột biến gen rpoB ở vi khuẩn lao liên quan kháng rifampicin.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG    PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis được chia làm 2 nhóm: kháng với rifampicin, gồm 29 chủng và nhạy với rifampicin, gồm 11 chủng (các chủng trên có nguồn gốc từ viện Lao và bệnh Phổi Trung  ương).  Chủng  chuẩn  quốc  tế  H37Rv  là chủng tham chiếu.
2.    Phương pháp nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lao được nuôi cấy trên môi trường Loweinstein – Jensen và làm kháng sinh đồ theo phương pháp kháng sinh đồ tỷ lệ. Để nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB chúng tôi tách chiết DNA vi khuẩn lao bằng quy trình sử dụng lysis buffer, lysozym, proteinase K, Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1) và tủa DNA bằng alcohol 100%.
Sử dụng kỹ thuật PCR nhân trình tự gen đích rpoB có độ dài 266bp với cặp mồi RpoBFW5CA- GATCCGG G TCGGCATGTCG CG GA3/ RpoBRv:5ACGTCGCGGACCTCCAGCCCGGCAC 3; chu kỳ luân nhiệt: 940C: 5 phút; (940C: 1 phút, 650C: 1 phút 720C: 2 phút) x 35 chu kỳ; 720C: 7 phút và giữ ở 40C. Sản phẩn PCR gen rpoB được tinh sạch bằng DNA Extraction Kit K0513 (Fermentas) sau đó được chèn vào vector pGEM – T easy (Promega) và biến nạp vào tế bào khả biến
E. coli DH5 theo phương pháp sốc nhiệt. Sau khi chọn dòng, tách plasmid và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen rpoB, chúng tôi thu được sản phẩm plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen rpoB 266bp. Mỗi chủng vi  khuẩn lao được chọn 3 dòng để giải trình tự. Thực hiện phản ứng PCR gắn BigDye, tinh sạch sản phẩm PCR, biến tính HiDi formamide theo quy trình của BigDye terminator v3.1. Đọc trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI 3130 – System. Phân tích các trình tự đoạn gen rpoB 266bp vi khuẩn lao thu được bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit v7.0. Thống kê xử lý số liệu với sự trợ giúp của chương trình StatView v5.0.
Vi khuẩn lao kháng rifampicin (RIF) là do có đột biến xảy ra chủ yếu ở vùng 81bp gen rpoB. Mục tiêu: xác định tần suất, đặc điểm đột biến gen rpoB ở vi khuẩn lao liên quan kháng RIF. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 40 chủng vi khuẩn lao gồm 11 chủng nhạy, 29 chủng kháng RIF. Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng như tách chiết DNA, PCR nhân đoạn gen, tách dòng gen, đọc trình tự và phân tích đột biến vùng 81bp gen rpoB. Kết quả: không phát hiện thấy đột biến vùng 81 bp của gen rpoB ở 100% các chủng vi khuẩn lao nhạy với RIF. Ở các chủng vi khuẩn lao kháng RIF tần suất đột biến là 96,6%. Có 12 vị trí xảy ra trên vùng 81 bp gen rpoB, các vị trí hay gặp là 531 (51,7%) và 526 (31%). Phát hiện vị trí đột biến 519 (3,4%) chưa có trong các công bố trên thế giới. Có 15 kiểu đột biến, trong đó kiểu TCG531TCG chiếm tỷ lệ 50%. Kháng đa thuốc gặp ở cả các chủng đột biến và không đột biến, ở tất cả các vị trí và kiểu đột biến. Kết luận: không phát hiện thấy đột biến gen rpoB ở các chủng vi khuẩn lao nhạy với RIF. Tần suất đột biến gen rpoB ở các chủng vi khuẩn lao kháng RIF là 96,6%. Phát hiện vị trí đột biến mới 519. Đột biến gen rpoB không quyết định tính kháng đa thuốc.