Đặc điểm Genotype của các chủng virus dại lưu hành ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam trong năm 2007 – 2008

Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ do virus dại thuộc họ Rabdoviridae, nhóm Lyssavirus gây nên, Lyssavirus có tới 7 genotype gây bệnh dại. Ổ chứa virus dại rất đa dạng bao gồm các động vật hoang dại và động vật gần người như chồn, cáo, chó sói, dơi, chó, mèo, ngựa, trâu, bò…. Bệnh lây truyền từ động vật sang người chủ yếu qua các vết cắn, cào hoặc liếm vào da, niêm mạc bị tổn thương, ngoài ra còn lây truyền  bệnh  dại qua đường không  khí và lây truyền từ người sang người cũng được báo cáo [3]. Hiện nay, Việt Nam vẫn chưa thực sự có những  nghiên  cứu  về  đường  truyền  virus,  các chủng virus dại hoang dại lưu hành ở động vật và người. Việc xác định genotype các chủng virus dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, góp phần nghiên cứu về đường truyền virus dại và dịch tễ học phân tử virus dại là rất cần thiết, đóng góp cho việc xây dựng chiến lược phòng chống và loại trừ bệnh dại trong tương lai. Mục tiêu:

1. Định týp  chủng  virus dại  bằng  kỹ  thuật sinh học phân tử.

2. Xây  dựng  cây  di truyền  của  virus  dại  ở miền Bắc Việt Nam.

II. ĐỐI  TƯỢNG,  VẬT  LIỆU  VÀ  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu
Bệnh  nhân  nghi dại  ở  các  tỉnh miền  Bắc  và miền Trung nằm tại bệnh viện Nhi Trung ương, bệnh viện các bệnh truyền nhiễm nhiệt đới Quốc Gia, bệnh viện Bạch Mai; chó nghi dại (ốm, bỏ ăn, kích thích) lấy tại lò mổ huyện Hoài Đức, Hà Nội.

2. Vật liệu

Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: dịch não tuỷ, nước bọt; bệnh phẩm từ động vật nghi dại: vùng đồi thị, đại não và tiểu não.Bộ sinh phẩm tách chiết ARN từ mô và dịch cơ thể (Qiagen).

Mồi khuếch đại gen N và giải trình tự gen (N7 và JW6E). Các  bộ  sinh phẩm  one step RT – PCR, tinh sạch  sản  phẩm  PCR  và  tinh  sạch  sản  phẩm sequencing (Qiagen); bigdye V3.1 (AB).

Phòng thí nghiệm P3 và các thiết bị cần thiết để  thực  hiện  kỹ  thuật  sinh học  phân  tử  và  giải trình tự gen.

Phần mềm Bio edit, phần mềm xây dựng cây di truyền  Mega 4; trình tự  sequence các  chủng virus dại thuộc các genotype khác nhau được lấy từ trang web: www.ncbi.nlm.nih.gov.

3. Phương pháp nghiên cứu

Tách chiết ARN virus dại từ mô não, dịch não tuỷ và nước bọt theo thường quy của bộ sinh phẩm hãng Qiagen.

Kỹ thuật RT – PCR:

Thành phần của 1 phản ứng: 20µl nước cất, 10µl đệm, 2µl dNTP mix, 3µl mồi xuôi (10µM), 3µl mồi ngược (10µM), 2 µl enzym mix và 10 µl ARN.

Chu kỳ nhiệt: 500C trong 30 phút, 950C 15 phút,

35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm có 940C 1 phút, 520C 1 phút và 720C 1,5 phút, cuối cùng 720C 10 phút.Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1%, xác định dương tính khi có băng ADN 600 nucleotide.

Kỹ thuật sequencing: thực hiện kỹ thuật se- quencing trực tiếp, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cột hoặc gel trước khi chạy PCR sequencing.Công thức PCR sequencing: 10 µl nước cất, 8 µl Bigdye, 1µl primer (3 µM), 1 µl ADN (100ng/µl).Chu kỳ nhiệt PCR sequencing: 900C 1 phút, 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm có 960C 10 giây, 500C 5 giây và 600C 4 phút, cuối cùng 40C.

Sản phẩm sequencing được tinh sạch bằng Dyex của  Qiagen. Đọc  trình tự  nucleoitide bằng máy sequencer AB genetic analyzer 3130. Phân tích trình tự sequence, xác định genotype và xây dựng cây di truyền bằng phần mềm Mega 4.