Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên glycolipid trong chẩn đoán huyết thanh học bệnh Lao

 Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) về mối nguy cơ bệnh lao đang quay trở lại cùng với tốc độ gia tăng dân số và đại dịch HIV/AIDS trên  toàn  thế  giới  .  Ước  tính  số người mắc lao mới sẽ là 11,8 triệu vào năm 2005 (tăng 57,8% so với 1990) [2]. Bệnh lao đã thực sự trở thành mối đe doạ đến sức khoẻ, tính mạng nhiều người. Tử vong do lao chiếm 1/4 số tử vong do nhiễm khuẩn ở người lớn. Việt Nam là 1 trong 22 nước có bệnh lao trầm trọng trên thế giới [10].

 

Chẩn đoán bệnh lao trên lâm sàng sẽ được khẳng định khi tìm thấy vi khuẩn trong bệnh phẩm bằng các phương pháp như nhuộm coi trực tiếp, nuôi cấy phân lập. Nhưng trong nhiều trường hợp không tìm thấy vi khuẩn lao bằng các phương pháp này do lấy, bảo quản và xử lý bệnh phẩm không tốt. Vì vậy các phương pháp chẩn đoán gián tiếp như các xét nghiệm miễn dịch, Mantoux, X quang đã góp phần đáng kể vào chẩn đoán. Ngày nay, miễn dịch học đã được áp dụng cả trong theo dõi diễn biến bệnh lao, phòng bệnh và theo dõi khả năng dung nạp thuốc của cơ thể [4].

 

Một trong những kỹ thuật miễn dịch được ứng dụng ngày càng rộng rãi là kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng vi khuẩn lao bằng kỹ thuật ELISA. Từ thập kỷ 70, đã có nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài và gần đây có một số tác giả trong nước đã áp dụng kỹ thuật này để phát hiện kháng thể kháng lao; giúp cho chẩn đoán, phát hiện bệnh lao, đặc biệt là với các trường hợp lao ngoài phổi và lao phổi BK (-) .

 

Tuy vậy, vấn đề quan trọng nhất trong huyết thanh học chẩn đoán lao là chất lượng kháng nguyên; vì Mycobacterium tuberculosis có nhiều loại kháng nguyên và có nhiều kháng nguyên chéo với các Mycobacteria khác [1]. Nhờ những tiến bộ về kỹ thuật mà những kháng nguyên của vi khuẩn cũng dần dần đ−ợc tinh chế tốt hơn để chẩn đoán bệnh lao.

 

Đã có nhiều kháng nguyên được dùng để chẩn đoán lao như: Protein 38 kDa, protein 30 kDa, lipoarabinomannan (LAM), glicolipid LDS, DAT, PGL Tb1, kháng nguyên A60…vv với độ nhậy và độ đặc hiệu rất khác nhau [7]. Các kháng nguyên protein có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn các kháng nguyên glycolopid nhưng bảo quản khó khăn hơn, vì vậy không được áp dụng rộng rãi trên thực tế.

 

Gần đây, phòng nghiên cứu vaccine BCG ở Nhật Bản đã đưa ra 6 loại kháng nguyên mới, được tinh chế từ vi khuẩn lao, bản chất hoá học là glycolipid. Để đánh giá giá trị chẩn đoán lao của kháng nguyên này, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm 2 mục đích:

 

• So sánh giá trị chẩn đoán của 6  loại kháng nguyên, tìm ra những kháng nguyên đặc hiệu, có  giá  trị  nhất  trong  chẩn đoán huyết thanh học bệnh lao.

 

• Đánh  giá  độ  nhậy,  độ  đặc  hiệu, phản ứng chéo của kỹ thuật ELISA với kháng nguyên glycolipid.

 

I. Đối tượng, và phương pháp nghiên cứu

 

1. Đối tượng

 

Tiến hành nghiên cứu trên huyết thanh của 168 người Việt Nam trong đó gồm:

• Nhóm I: 62 bệnh nhân lao phổi tuổi từ 15- 75 được chẩn đoán là lao BK (+) tại Viện lao-Bệnh phổi Hà Nội và bệnh viện Lao Quảng Ninh.

 

• Nhóm II: 53 người lành tuổi từ 15- 75. Những ng−ời này đ−ợc coi là  lành  nếu không mắc bệnh nhiễm trùng  nào vào thời điểm lấy mẫu nghiên cứu.

 

• Nhóm III: 53 bệnh nhân tuổi từ 15-75, có mắc ít nhất một bệnh nhiễm  trùng (không phải lao).

 

2. Vật liệu

 

• Bộ sinh phẩm ELISA lao (BCG  Lab, Tokyo, Nhật Bản). Phiến nhựa 96 giếng có gắn 6 kháng nguyên tinh chế, bản chất hoá học là lipid:

 

-Hàng A (P2): Phosphoinositomannoside

 

-Hàng B (DT): 6, 6 -dimycolyltrehalose (cord factor)

 

-Hàng C (MT): Trehalose monomycolate 

 

-Hàng D (PA): Phenol glycolipid

 

-Hàng E (MI): Glycolipid

-Hàng F (Co): Glycopeptide

 

-Hàng G: Làm nền (Background) cho kháng nguyên DT và PA (hàng B và D).

 

-Hàng H làm nền cho kháng nguyên P2, MT, MI và Co (các hàng A, C, E, F).

 

Người làm xét nghiệm không được biết bản chất kháng nguyên của từng hàng.

 

• Các hoá chất kèm theo: Đệm PBS (viên nén)-T  (Tween  20),  đệm   citrate-phosphate; cộng  hợp:  (HRP-  Goat  Anti-  Human  IgG), H2O2 và o-phenylendiamine (OPD).

 

3. Phương pháp

 

Huyết thanh: Lấy 2 ml máu tĩnh mạch, không chống đông. Tách huyết thanh rồi giữ trong tủ lạnh sâu -70° C cho đến khi làm phản ứng.

 

Kỹ thuật ELISA (Enzymed-Linked Immunosorbent Assay):

 

Những giếng có sẵn gắn kháng nguyên lao cho tiếp xúc với kháng thể kháng lao có trong huyết thanh người bệnh, cho thêm chất cộng hợp (kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase) tạo nên một phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể-Kháng kháng thể-Enzyme. Kết quả đ−ợc phát hiện nhờ màu sắc đ−ợc tạo ra do phản ứng của enzyme với cơ chất cho thêm vào. Trong kỹ thuật này, dung dịch có mầu vàng, phổ hấp phụ màu của dung dịch đo được ở b−ớc sóng 490/620 nm. Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ kháng thể kháng lao trong huyết thanh người bệnh.

 

Kỹ thuật tiến hành:

 

– Cố định kháng nguyên: cho 150 àL dung dịch PBS-T vào mỗi giếng, để 10 phút ở nhiệt độ phòng.

 

– Huyết thanh bệnh nhân: cho 50 àl  huyết thanh bệnh nhân đã pha loãng 1/201  vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ sau đó rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-T.

 

– Cộng hợp: thêm 50 àl cộng hợp  (1/500) vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ, sau  đó rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-T

 

– Cơ chất: thêm 50 àl dung dịch OPD  (1 mg/ml) có chứa sẵn H2O2  0,06%, để 30 phút ở nhiệt độ phòng.

 

 

– Dừng phản ứng: thêm 50 àl H2SO4 1N. Đọc kết quả ở b−ớc sóng 490/620 nm