Đánh giá hiệu quả qui trình tạo khối tế bào gốc từ tủy xương để điều trị khớp giả, chậm nền xương

Sử dụng tế bào gốc tự thân lấy từ tủy xương để điều trị khớp giả, chậm liền xương đã được ứng dụng thành công trên thế giới. Để áp dụng phương pháp điều trị mới này ở Việt Nam cần xây dựng một qui trình tạo khối tế bào gốc từ tủy xương vừa phù hợp với điều kiện Việt Nam vừa thu được những khối tế bào gốc với thành phần tế bào cần thiết cho điều trị. Mục tiêu. Thực hiện qui trình và đánh giá hiệu quả loại bỏ những thành phần tế bào không cần thiết và hiệu quả thu hồi thành phần tế bào gốc cần thiết. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu. 30 bệnh nhân khớp giả, chậm liền xương thân xương dài (23 nam, 7 nữ), mỗi bệnh nhân được chọc    hút 240 ml    dịch    tủy    xương    từ mào    chậu,    chống    đông bằng    dung    dịch Heparin, tiếp tục thực hiện qui trình chiết tách và cô đặc giảm thể tích nhằm loại bớt các tế bào dòng hồng cầu và bạch cầu hạt, tập trung các tế bào đơn nhân trong đó có các tế bào gốc. Kết quả: khối tế bào gốc thu được sau qui trình chiết tách và cô đặc có những đặc điểm như sau. 1) Tỷ lệ hồng cầu (HC), huyết sắc tố (HST), bạch cầu hạt (BCH) được loại bỏ lần lượt là 99,67 ± 0,14 %; 99,35 ± 0,38%; 80,07 ± 14,28% ; 2) Nồng độ tế bào có nhân. 50,79 ± 23,35 G/l với tỷ    lệ tế bào    gốc CD34+ chiếm    1,41% ± 0,91%,    nồng    độ    tế bào    gốc    CD34+    là
656,51 ± 411,65 /^l , tống số tế bào gốc CD34+ là 18,93± 10,75 x 106 tế bào với tỷ lệ thu hồi là 56,25% ± 20,81% Kết luận: Qui trình tạo khối tế bào gốc từ tủy xương của các bệnh nhân khớp giả, chậm liền xương dùng cho mục đích điều trị đã được thực hiện với hiệu quả cao trong loại bỏ những thành phần tế bào không cần thiết và thu hồi thành phần tế bào gốc cần thiết.
1.    Đặt vấn đề
Tế bào gốc (stem cell) là một dạng tế bào đặc biệt có khả năng tự tái tạo và biệt hoá thành những loại tế bào chuyên biệt. Tủy xương là một trong những kho dự trữ tế bào gốc của cơ thể trưởng thành. Ngoài tế bào gốc tạo máu (hematopoietic stem cell-HSC) đã được nghiên cứu từ lâu, tủy xương còn chứa tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell-MSC), có thể biệt hoá thành các tế bào trưởng thành thuộc trung mô như tổ chức mỡ, xương và sụn. Gần đây, người ta còn thấy tuỷ xương cũng chứa các tế bào có khả năng biệt hoá thành các tế bào trưởng thành không thuộc tổ chức tạo máu như các tế bào nội mạc của gan, thận, phổi, da, đường tiêu hoá và các tế bào cơ tim và cơ vân. Vì vậy, dường như tuỷ xương có chứa hỗn hợp một vài loại tế bào gốc gồm cả những tế bào gốc tạo máu hoặc không tạo máu như. tế bào gốc tạo máu, tế bào đệm và có thể là các tế bào đầu dòng của nội mạc…[2,6]
Khớp giả (KG), chậm liền xương (CLX) là những diễn biến bất thường sau gãy xương thường gặp với tỷ lệ tương ứng 2-3% và 4-5%, do nhiều nguyên nhân gây nên. Việc điều trị không đơn giản, đôi khi phải cần đến nhiều phẫu thuật khác nhau, thời gian nằm viện kéo dài, có thể để lại nhiều di chứng nặng nề, thậm chí phải cắt cụt chi. Những năm gần đây tế bào gốc được nghiên cứu ứng dụng trong điều trị khớp giả, chậm liền xương thân xương dài và đã đạt được kết quả đầy hứa hẹn. Connolly đã điều trị thành công khớp giả chỉ đơn thuần bằng ghép tế bào gốc tủy xương tự thân và chứng minh được mối tương quan thuận giữa khả năng tạo xương và nồng độ tế bào gốc được ghép vào vị trí tổn thương [5]. Nhiều tác giả sau đó cũng thu được kết quả tương tự [3,7]. Dịch tủy xương có chứa các tế bào gốc với số lượng hạn chế, còn lại đa số là các tế bào đang trưởng thành hoặc đã trưởng thành không có vai trò gì trong tạo xương. Vì vậy để đạt được yêu cầu điều trị, cần thiết phải xử lý chế biến dịch hút từ tủy xương để tập trung được số lượng tế bào gốc với đậm độ cần thiết cho quá trình liền xương và loại bớt các thành phần tế bào không cần thiết. Ở Việt Nam, ứng dụng tế bào gốc trong điều trị các tổn thương xương khớp khó liền bắt đầu được quan tâm và cần được nghiên cứu một cách đầy đủ, có hệ thống để làm sáng tỏ tính an toàn và hiệu quả của phương pháp điều trị các tổn thương xương khớp khó liền bằng khối tế bào gốc của tủy xương. Xây dựng một qui trình thu gom, chiết tách, cô đặc dịch tủy xương để thu được khối tế bào gốc với thành phần và đậm độ tế bào cần thiết, phù hợp với điều kiện kinh tế và trang thiết bị ở Việt Nam là tiền đề cần thiết cho phương pháp điều trị mới này. Do đó chúng tôi đã thực hiện qui trình tạo khối tế bào gốc từ tủy xương bằng phương pháp thủ công và tiến hành đề tài “Đánh giá hiệu quả qui trình tạo khối tế bào gốc từ tủy xương để điều trị khớp giả, chậm nền xương ” nhằm mục tiêu:
-Đánh giá hiệu quả loại bỏ những thành phần tế bào không cần thiết cho điều trị
-Đánh giá hiệu quả thu hồi những thành phần tế bào gốc cần thiết cho điều trị
2.    Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.    Đối tượng nghiên cứu:
30 bệnh nhân được chẩn đoán là khớp giả, chậm liền xương thân xương dài điều trị tại Bệnh viện TƯQĐ 108 và Bệnh viện Việt Đức từ tháng 1 đến tháng 9 năm 2009. *Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:
–     Những bệnh nhân được chẩn đoán khớp giả chặt, chậm liền thân xương dài sau kết xương kim loại hoặc điều trị bảo tồn bằng bột
–    Có đầy đủ hồ sơ, bệnh án, phim X quang theo dõi trước và sau mổ.
–    Không có những bệnh cấp tính đang tiến triển, xét nghiệm HIV (-).
–    Tiêu chuẩn chẩn đoán khớp giả chặt: trên lâm sàng và X quang không có dấu hiệu liền xương, còn đau và không có di động tại ổ gãy với thời gian ít nhất 6 tháng từ khi gãy xương.
-Tiêu chuẩn chẩn đoán chậm liền : trên lâm sàng và X quang không thấy dấu hiệu liền xương với thời gian ít nhất 3 tháng từ khi gãy xương.
-Bệnh nhân chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu *Tiêu chuẩn loại trừ: những bệnh nhân không có đủ những tiêu chuẩn lựa chọn trên
2.2.    Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.     Thiết kế nghiên cứu: Tiến cứu can thiệp lâm sàng cắt ngang
2.2.2.    Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
–    Qui trình tạo khối tế bào gốc từ tủy xương
Chọc hút dịch tủy xương: gây tê tủy sống, chọc hút dịch tủy xương từ hai mào chậu trước hoặc sau để thu gom khoảng 240 ml dịch tuỷ xương (tiến hành trong phòng mổ vô trùng), chống đông bằng 100 mL dung dịch Heparin (5000 đ.v Heparin /100 ml nước muối sinh lý). Cuối cùng thu được khoảng 340 ml dịch tủy xương thô (chưa xử lý).
Tách chiết cô đặc khối tế bào gốc từ dịch tuỷ xương thô tiến hành trong điều kiện vô trùng (trong Hot Laminair-hãng Labcaire của Anh quốc) bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng, sử dụng dung dịch Ficoll có tỷ trọng 1,077 g/l: hút dịch tủy xương vào các ống Facon 50 ml đã có sẵn 15 ml dung dịch Ficoll , ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút ở nhiệt độ 22°C trong 30 phút bằng máy ly tâm có điều khiển nhiệt độ (hãng Herius -CHLB Đức). Hồng cầu (HC), bạch cầu hạt (BCH) và các tế bào có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của dung dịch Ficoll sẽ lắng xuống dưới, còn các tế bào monocyte, lymphocyte, các tế bào gốc… nhẹ hơn sẽ tạo thành một vòng nhẫn nằm ở lớp phía trên dung dịch Ficoll. Dùng Pippet Paster hút lớp tế bào này, rửa hai lần bằng nước muối sinh lý, ly tâm để tạo ra sản phẩm khối tế bào gốc cuối cùng là 30 ml huyền dịch cặn tế bào với nước muối sinh lý. Hỗn dịch tế bào này được hút vào bơm tiêm để dùng ngay, tiêm qua da vào vị trí khớp giả, chậm liền xương của bệnh nhân, đồng thời được lấy mẫu để kiểm tra chất lượng (xác định các thành phần tế bào, tỷ lệ và số lượng tế bào gốc CD34(+), cấy khuẩn…).
–    Xét nghiệm tế bào máu và tủy xương: sử dụng máy đếm tế bào tự động CD1800 (Abbott- Hoa Kỳ) và phương pháp tế bào học kinh điển (nhuộm Giemsa và quan sát trên