ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỈNH SỬA GEN BCL11A TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA PROTEIN CAS9 TÁI TỔ HỢP, ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HỒNG CẦU LIỀM

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỈNH SỬA GEN BCL11A TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA PROTEIN CAS9 TÁI TỔ HỢP, ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HỒNG CẦU LIỀM
Đỗ Như Bình1
1 Bệnh viện Quân Y 103
Nội dung chính của bài viết
Tóm tắt
Mục tiêu: Thiết kế phức hợp rCas9/sgRNA để chỉnh sửa gen BCL11A tách dòng vào plasmid pJET1.2 trong điều kiện in vitro nhằm đánh giá hoạt tính protein Cas9 tái tổ hợp và định hướng ứng dụng điều trị bệnh hồng cầu liềm. Đối tượng và phương pháp: Khuếch đại vùng Enhancer của gen BCL11A bằng phản ứng PCR, phân tích so sánh trình tự với DNA của người Việt Nam. Thiết kế chuỗi đơn RNA dẫn đường (sgRNA) và tạo phức hợp rCas9/sgRNA. Thử nghiệm hoạt tính phức hợp trêngen BCL11A đã được tách dòng vào plasmid pJET1.2 trong điều kiện in vitro. Kết quả: Phức hợp rCas9/sgRNA tổng hợp được đã cắt vùng enhancer của gen BCL11Atrên in vitro thành 2 sản phẩm có kích thước khoảng 240bp. Giải trình tự gen sảm phẩm PCR cho thấy phức hợp rCas9/sgRNA đã cắt vùng gen enhancer GATAA của BCL11A tại vị trí cách vùng PAM 3 cặp nucleotide theo đúng tính toán lý thuyết. Kết luận: Protein Cas9 tái tổ hợp có hoạt tính tương tự protein Cas9 tự nhiên và phức hợp rCas9/sgRNAcần được tiếp tục nghiên cứu đểứng dụng trong chỉnh sửa gen BCL11A điều trị bệnh hồng cầu liềm trên lâm sàng.

Công  nghệ  chỉnh  sửa  gen  sử  dụng CRISPR/Cas9 là một trong những tiến bộ vượt bậc trong lĩnh vực sinh học phân tử,đã và đang được  ứng  dụng  rộng  rãi  trong  các  lĩnh  vực  từ sinh học, nông nghiệp, y học. [1],[3]. Trong lĩnh vực y học, các nhà khoa học đã ứng dụng công nghệ CRISPR để chữa các bệnh di truyền [5],[6]. Hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm 2 thành phần: enzyme  Cas9  nuclease  và  RNA  dẫn  đường (sgRNA).  Nhờ  đoạn  trình  tự  bổ  sung  của  RNA dẫn đường với trình tự đích mà phức hợp này có thể tìm thấy vị trí cần chỉnh sửa trên hệ gen.Để có thể hoạt động, hệ thống CRISPR còn yêu cầu một trình tự ngắn từ 2-5  nucleotides  trên  DNA đích  được  gọi  là  protospacer  associated  motif (PAM)  ngay  sau  đoạn  bổ  sung  của  RNA  dẫn đường  (đối  với  CRISPR/Cas9  của  vi  khuẩn S.pyogenes thì trình tự này là 5’-NGG, trong đó N  làbất kỳ nucleotide nào). Khi phức hợp Cas9 và  guide  RNA  bám  vào  trình  tự  đích,  enzyme Cas9  sẽ  dùng  2  tiểu  phần  HNH  và  RuVC  của mình để cắt đoạn DNA trên cả 2 mạch tại vị trí nucleotide thứ 3-4 phía trước PAM [4],[7].Thiếu máu hồng cầu hình liềm là một bệnh nặng do cơ thể tạo ra những tế bào hồng cầu có hình liềm. Nguyên nhân là do đột biến xảy ra ở vị trí thứ 6 trên chuỗi beta globin thuộc phân tử hemoglobin, gây biến đổi axit glutamic ưa nước thành  axit  valine  kỵ  nước.  Việc  điều  trị  bệnh hồng cầu hình liềm hiện nay chủ yếu sử dụng các liệu pháp như truyền máu, ghép tế bào gốc hay ghép tủy xương. Tuy nhiên, liệu pháp này cũng có nhiều biến chứng nguy hiểm và chỉ thực hiện được ở những trung tâm huyết học lớn và hiện đại.Sự ra đời công nghệ CRISPR/Cas9 đã cho phép các nhà khoa học xây dựng những liệu pháp gen để sửa chữa các sai hỏng trong DNA bộ gen trong các bệnh lý di truyền, trong đó có bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm. Có 3 liệu pháp  gen  được  đề  cập  trong  chữa  bệnh  hồng cầu hình liềm là sửa chữa lại đột biến trên chuỗi beta-globin,  thay  thế  đoạn  gen  bị  đột  biến  và tăng sản xuất hồng cầu bào thai bằng cách gây đột biến gen hoặc bất hoạt enhancer gen điều hòa  tổng  hợp  protein  BCL  (B-cell  lymphoma/leukemia)11A [5].Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng protein tái tổ hợp Cas9 (rCas9) được tổng  hợp trong E.coliBL21/DE3 từ  nghiên  cứu trước, tiến hành thiết lập hệ thống rCas9/sgRNA để  chỉnh  sửa  gen  BCL  11A  trong  điều  kiện  in vitro nhằm đánh giá hoạt tính protein Cas9 tái tổ hợp và định hướng ứng dụng điều trị bệnh hồng cầu liềm