Đánh giá qui trình kỹ thuật sinh thiết biểu mô vùng rìa giác mạc dùng tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy

Sự hiểu biết về tế bào nguồn biểu mô giác mạc (GM) và sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào đã mở ra hướng mới trong điều trị hội chứng suy giảm tế bào nguồn biểu mô GM [1 – 8]. Chức năng của các tế bào nguồn ở vùng rìa đã được nhiều nhà nhãn khoa nghiên cứu và kết luận có 3 chức năng cơ bản: (1) Là nguồn bù đắp về mặt số lượng tế bào biểu mô GM (2) Biệt hóa thành tế bào biểu mô GM (3) Ngăn chặn không cho biểu mô kết mạc xâm lấn lên bề mặt GM [9 – 12].  Các tác giả đã xác định tế bào nguồn của biểu mô GM nằm ở lớp đáy trong những ổ vi môi trường của biểu mô vùng rìa giác mạc. Do đó, để tiến hành nuôi cấy tạo tấm biểu mô GM thành công thì kỹ thuật sinh thiết mẫu biểu mô vùng rìa có vai trò quan trọng hàng đầu [1]. Mặt khác, kỹ thuật sinh thiết biểu mô vùng rìa không được mô tả trong y văn của các tác giả nước ngoài đã công bố. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm mục tiêu: Đánh giá quy trình kỹ thuật  sinh  thiết  mẫu  mô  vùng  rìa  giác  mạc phục vụ cho việc nuôi cấy tạo tấm biểu mô giác mạc.
I.    ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU
1.    Thực nghiệm
    Đối   tượng:   Thỏ   chủng    Orytolagus Cuniculus cả 2 giống, khỏe  mạnh, trọng lượng 2 ± 0,2 kg do trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn tây cung cấp.
    Quy trình phẫu thuật sinh thiết biểu mô vùng rìa giác mạc thỏ
–    Thỏ được cố định trên giá, gây mê  bằng thiopentan qua đường tĩnh mạch rìa tai, gây tê tại mắt bằng lidocain 2%.
–    Mắt thỏ được khử trùng bằng povidon iodine trước và sau phẫu thuật.
–    Bộc lộ nhãn cầu vùng phẫu thuật.
–    Đánh dấu vùng rìa sinh thiết: Dùng dao  số 15, tạo các đường rạch sâu khoảng 0,15mm, khu vực rìa từ vị trí 11 giờ đến 1giờ.
Đường rạch phía kết mạc dài 5mm cách 0,5mm từ ranh giới củng giác mạc.
Đường rạch phía GM dài 5 mm, cách khoảng 1 mm từ ranh giới củng giác mạc.
–    Dùng  dao  số  15  lạng  lấy  lớp  nông  dày khoảng  0,15  mm  vùng  rìa  đã  đánh  dấu  trên, mảnh mô vùng rìa lấy được sẽ có kích thước 1,5 x 5 x 0,15 mm.
–    Mảnh mô được rửa bằng dung dịch DPBS, có pha kháng sinh, kháng nấm, rồi được chia thành 3 mẫu nuôi cấy có kích thước 1,5 x 1,5  x 0,15 mm, chuyển vào phòng nuôi cấy.
–    Mảnh mô được xử lý bằng  enzym  và nuôi
cấy tạo tấm biểu mô GM trong cùng một điều kiện: trên nền màng ối người , sử dụng môi trường SHEM, ở nhiệt độ 370C, 5% CO2  trong thời gian 14 – 16 ngày.
2.    Trên người
    Đối tượng: Bệnh nhân bị bỏng một mắt do kiềm. Mẫu mô vùng rìa được lấy từ mắt lành của bệnh nhân.
    Quy trình phẫu thuật lấy mẫu mô vùng rìa trên mắt lành người bệnh
–    Đặt vành mi, bộc lộ vùng rìa củng –  giác mạc lấy mẫu biểu mô. Tê bề mặt nhãn cầu bằng thuốc tê tra mắt dicain 1%, tra  thuốc  sát trùng betadine 5%.
–    Tách kết mạc gần rìa phía trên từ vị trí 11 giờ đến 1 giờ, cách rìa khoảng 1 mm bằng kéo vanas.
–    Dùng dao tròn tách lớp biểu mô vùng rìa có kích thước rộng khoảng 3 mm x dài 5 mm, ngâm trong  môi  trường  vận  chuyển  bệnh  phẩm  tới phòng nuôi cấy, thời gian khoảng 20 – 30 phút.
–    Mảnh mô được rửa bằng dung dịch DPBS, có pha kháng sinh, kháng nấm, rồi được chia thành 2 – 6 mẫu nuôi cấy.
–    Mảnh mô được xử lý bằng enzym và nuôi cấy tạo tấm biểu mô GM trong cùng một điều kiện: trên nền màng ối người , sử dụng môi trường SHEM, ở nhiệt độ 370C, 5% CO2.
Đánh giá quy trình kỹ thuật sinh thiết mẫu mô vùng rìa giác mạc sử dụng cho việc nuôi cấy tạo tấm biểu mô giác mạc (GM). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu, mô tả lâm sàng tiến hành trên thực nghiệm và trên bệnh nhân từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 3 năm 2009. Mảnh mẫu biểu mô vùng rìa được lấy ở vị trí rìa phía trên, kích thước 3 x 5 mm, diện tích khoảng 15 mm². Nuôi cấy trong môi trường phát triển biểu mô có bổ sung hormon (Supplemental Hormonal Epithelial Medium – SHEM), nhiệt độ 37oC tạo tấm biểu mô giác mạc với giá đỡ là màng ối người. Kết quả: Tỷ lệ thành công tạo tấm biểu mô giác mạc trên thực nghiệm là 82% trong thời gian nuôi cấy là 2 tuần. Trên bệnh nhân, thời gian nuôi cấy tạo tấm biểu mô khoảng 3 – 4 tuần tỷ lệ thành công là 67%. Các tấm biểu mô GM với 4 – 5 hàng tế bào và các tế bào biểu mô GM có hình dạng bình thường. Từ tấm biểu mô GM nuôi cấy trên thực nghiệm, bằng phương pháp hóa mô miễn dịch đã xác định được loại keratin đặc trưng của tế bào biểu mô GM (K3)  Kết luận: Kỹ thuật sinh thiết mẫu biểu mô vùng rìa là một trong những bước quan trọng quyết định sự thành công của quá trình tạo tấm biểu mô GM nuôi cấy. Đặc biệt, trên bệnh nhân việc tiết kiệm tổ chức lành là việc cần cân nhắc và tính ưu việt của việc sử dụng tấm biểu mô GM nuôi cấy là có thể nhắc lại phẫu thuật khi cần thiết