Đánh giá sự sao chép mRNA của HIP ở mô ung thư vú theo giai đoạn và theo các thể tế bào học khác nhau sử dụng kỹ thuật RT-PCR bán đinh lượng

Heparansulfate Interacting Protein (HIP) thuộc nhóm protein liên kết với heparin và heparansulfate (HP/HS). HIP đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển, phân chia, biệt hoá và nhận biết của tế bào. HIP được phát hiện ở một số dòng tế bào nội mạc biểu mô và ở một số dòng tế bào ung thư ở cả mức độ mRNA và protein. Đặc biệt, mức độ biểu hiện của HIP liên quan chặt chẽ tới giai đoạn phát triển, tình trạng biệt hóa và mức độ ác tính của từng dòng tế bào. Mục tiêu: Đánh giá mức độ sao chép mRNA của HIP ở mô ung thư vú so với mô u xơ; so sánh mức độ sao chép của HIP ở các giai đoạn ung thư khác nhau và các thể loai tế bào học khác nhau. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tách chiết RNA tổng số từ 62 mẫu mô (47 mẫu mô ung thư vú và 15 mô u xơ); tổng hợp cDNA bằng kỹ thuật sao chép ngược (reverse transcript-polymerase chain reaction/RT-PCR); đánh giá mức độ sao chép của mRNA HIP bằng kỹ thuật RT-PCR bán định lượng. Kết quả: Sự sao chép của HIP tăng rõ ở mô ung thư vú so với mô u xơ và mức độ sao chép này còn phụ thuộc vào các giai đoạn và ở các thể loại tế bào học khác nhau của ung thư vú. Kết luận: Kết quả này chỉ ra rằng, mức độ sao chép mRNA của HIP khác biệt nhau một cách rõ rệt giữa mô ung thư và u xơ vú và phụ thuộc vào giai đoạn phát triển, mức độ ác tính của từng dòng tế bào ung thư; HIP có thể được sử dụng như một marker có giá trị góp phần chẩn đoán loại hình ung thư này.
I.    ĐẶT VẤN ĐỂ
Ung thư vú (UTV) là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới. Theo quan niệm trước đây UTV chỉ là căn bệnh tại chỗ nhưng gần đây dựa trên cơ sở sinh bệnh học, người ta xác định UTV là một bệnh toàn thân. UTV là loại ung thư đứng đầu và chiếm 21% trong tổng số các bệnh ung thư của phụ nữ trên toàn thế giới [1]. Tỷ lệ mắc UTV ngày càng gia tăng do các yếu tố về môi trường, di truyền, chế độ ăn và nội tiết. Năm 2002, thế giới có gần 1,1 triệu ca mới mắc và 400000 trường hợp tử vong do ung thư vú. Nhưng đến năm 2005, ung thư vú đã gây ra 502000 ca tử vong. Tại Anh, năm 2005, có khoảng gần 80/100000 dân ca mắc mới và khoảng 27/100000 dân trường hợp tử vong [Theo WHO]. Tại Pháp, ung thư vú gây ra 11000 ca tử vong năm 1997 nhưng đến năm 2000 đã có 41485 ca mới mắc. Đây là loại ung thư có nguy cơ mắc bệnh tăng cùng theo lứa tuổi, ba giai đoạn người phụ nữ có nguy cơ cao nhất mắc ung thư vú là: tuổi bắt đầu hành kinh, tuổi sinh đẻ lần đầu tiên, và tuổi mãn kinh. Theo con số thống kê ở Pháp năm 2000, khoảng dưới 10% ung thư vú ở tuổi 40; 25% trước tuổi 50, và khoảng 50% ung thư vú ở tuổi trên 60.
Ớ Việt Nam, tỷ lệ ung thư vú khác nhau giữa hai miền Nam – Bắc. Ớ miền Bắc, ung thư vú đứng hàng đầu với tỷ lệ 21,8/100.000 phụ nữ trong khi ở miền Nam ung thư vú đứng thứ hai sau ung thư cổ tử cung. Theo ghi nhận của Bệnh viện K Hà Nội năm 2000 tỷ lệ mắc bệnh UTV chung cho cả nước là 17,4/100.000 phụ nữ. Nam giới cũng mắc UTV nhưng chỉ bằng 1% so với nữ giới. Tuổi mắc bệnh UTV thường ở tuổi 40 trở lên, cao nhất ở tuổi trên dưới 60; tuy nhiên cũng có thể gặp UTV ở nữ thanh niên sau tuổi dậy thì, hoặc cụ già trên 90 tuổi. Điều trị ung thư tốn kém và ít hiệu quả. Vì v, việc tìm hiểu cơ chế ung thư ở mức độ phân tử để từ đó tìm ra phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị sớm là hướng nghiên cứu đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm.
Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại phân tử mang điện âm với độ sulphate hóa rất cao, có khả năng tương tác với nhiều loại protein trong các quá trình sinh học và đóng vai trò rất quan trọng trong việc hình thành và duy trì cấu trúc chức năng của tế bào và mô [3]. Khi nghiên cứu nhóm protein gắn ái lực với HP/HS, Carson, DD và cộng sự đã phát hiện ra một protein mới ở tế bào biểu mô tử cung người và đặt tên là Heparansulfate Interacting Protein (HIP) [6]. HIP là một protein có 159 aa, trọng lượng phân tử khoảng 24 kDa, pI là 11,75 [7]. HIP có một số chức năng sinh học như: i) tham gia quá trình liên kết tế bào-tế bào thông qua đó tác động đến quá trình di căn; ii) gắn đặc hiệu và chọn lọc với HP/HS iii) tham gia điều hoà quá trình đông máu [6,7].
Bằng kỹ thuật sao chép ngược (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction/RT-PCR), sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế từ trình tự mã hoá các acid amin trên chuỗi peptid của HIP, Lui và cộng sự đã tổng hợp thành công chuỗi DNA bổ sung (complementery DNA/cDNA) của HIP. HIP được tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào nội mạc biểu mô trong khi không phát hiện được ở dòng tế bào sợi và tổ chức liên kết.
Gần đây, nghiên cứu của một số tác giả đã chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ mRNA và protein như: ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư giáp. Đặc biệt mức độ biểu hiện của HIP phụ thuộc vào giai đoạn phát triển và biệt hoá của tế bào ung thư [4], [5], [8]. Nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng HIP như một marker trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư vú, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục đích “Đánh giá sự sao chép mRNA của HIP ở mô ung thư vú theo giai đoạn và theo các thể tế bào học khác nhau sử dụng kỹ thuật RT-PCR bán đinh lượng”.
II.    ĐỐI TƯỢNG, HOÁ CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
1.    Đối tượng nghiên cứu
Gồm 62 mẫu mô trong đó có 47 mẫu mô ung thư vú và 15 mẫu mô u xơ. Tất cả các mẫu mô này được lấy từ các bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định tại bệnh viên K trung ương dựa vào lâm sàng và cận lâm sàng (mô bệnh học, XQ, hoá sinh). Bệnh nhân chỉ bị ung thư vú, ngoài ra không mắc bất kỳ loại hình bệnh tật, ung thư nào khác. Trong 47 mẫu mô ung thư vú, chúng tôi cũng lựa chọn các mẫu theo giai đoạn khác nhau ở cùng một thể loại ung thư, hay các thể loại tế bào học khác nhau ở cùng một giai đoạn ung thư để so sánh sự khác nhau giữa các giai đoạn và thể tế bào học của ung thư vú.
2.    Phương pháp nghiên cứu
2.1.    Tách chiết RNA tổng sô’
Mô bệnh phẩm phẩm (120 – 150 mg) sẽ được nghiền trong 1ml dung dịch isogen tạo thành hỗn hợp dịch đồng nhất. Dịch nghiền được chuyển sang ống eppendorf, để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Thêm 0,2 ml chloroform, lắc nhẹ nhàng 15 giây, để ở nhiệt độ phòng 2-3 phút, ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, hút lấy phần dung dịch trên cùng, đây là phần dịch có chứa RNA.
Thêm 0,5 ml isopropanol, lắc nhẹ nhàng 15 giây, để yên ở nhiệt độ phòng 5-10 phút. Lúc này nếu lượng RNA nhiều ta có thể nhìn thấy tủa RNA xuất hiện, ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Giữ lại phần cặn ở đáy ống.
Rửa tủa bằng ethanol 75%, ly tâm thu hồi tủa và hoàn tan bằng 20 ụ! nước cất có diethyl- pyrocarbonat (DEPC).
2.2.    Kỳ thuật tổng hợp ngược cDNA (RT-PCR)
cDNA được tổng hợp từ 2-3 ụg RNA tổng số với sự tham gia của enzym sao mã ngược MMLV-RT, 10 pmol mồi ngẫu nhiên (random primer), dNTPs, chất ức chế protein DTT 0,1M và chất ức chế phân huỷ RNA (RNAase out).
3.3.    RT-PCR bán định lượng khuếch đại gen mã hóa HỈP ở mô ung thư vú
Sử dụng quy trình đã được mô tả bởi nhóm nghiên cứu của TS. Tạ Thành Văn và CS. Cặp mồi đặc hiệu với HIP đã được ứng dụng để đánh giá mức độ sao chép của HIP. Gen GAPDH được dùng để kiểm tra chất lượng cDNA và so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng.
Quy trình có thể được mô tả chi tiết như sau:
– Thành phần phản ứng RT- PCR: Phản ứng RT-PCR được tiến hành với tổng thể tích 20 ụl gồm: 1 x Ex-Taq buffer; 2,5 mM dNTPs; 10 pmol mồi xuôi và ngược; 1 unit Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc. Kyoto, Japan), 150 ng cDNA ( với cặp mồi HỈP) hoặc 300 ng cDNA ( với cặp mồi GAPDH).
Chu kỳ của phản ứng RT-PCR: 940C – 5 phút; [940C – 50 giây, 580C – 50 giây, 720C – 50 giây] trong 35 chu kỳ; 720C – 5phút; bảo quản ở 40C
Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và nhuộm với ethidium bromide, sau đó được chụp ảnh và xử lý bằng phần mềm chuyên dụng. Tỷ lệ đậm độ vạch của gen