ĐẾM TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CD34⁺ BẰNG MÁY PHÂN

TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY (FLOW CYTOMETER)

(Hematopoietic stem cell CD34+ enumeration test by flow cytometry)

 

NGUYÊN LÝ

Tế bào gốc tạo máu có kháng nguyên CD34 trên bề mặt. Nếu ủ kháng thể anti CD34 với mẫu bệnh phẩm có tế bào gốc tạo máu, kháng thể này sẽ gắn đặc hiệu lên bề mặt các tế bào gốc tạo máu mang CD34. Dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phân tích trên máy phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometer) có thể đếm chính xác số lượng và tỷ lệ % tế bào gốc tạo máu CD34 trong mẫu bệnh phẩm.

CHỈ ĐỊNH

Các trường hợp cần đếm số lượng tế bào gốc tạo máu CD34+.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy phân tích tế bào dòng chảy (có thể phân tích các kênh màu huỳnh quang 7ADD, FITC và PE).

Máy ly tâm ống máu.

Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.

Găng tay.

Hóa chất

Bộ kít đếm CD34 gồm có các hóa chất sau: 7AAD, CD45 – FITC/CD34 – PE, CD45 – FITC/Isotype Control – PE, hạt tham chiếu (có nồng độ xác định), dung dịch ly giải hồng cầu.

Các dung dịch chạy máy và dung dịch rửa máy để vận hành máy phân tích tế bào dòng chảy;

Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

Bệnh phẩm

Bệnh phẩm có thể là mẫu máu ngoại vi, mẫu máu cuống rốn, mẫu lấy từ khối tế bào gốc máu ngoại vi tươi hoặc khối tế bào gốc máu ngoại vi đông lạnh sau rã đông, hoặc mẫu dịch hút tủy xương.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

Lấy tối thiểu 0,5 ml mẫu bệnh phẩm. Nếu mẫu bệnh phẩm là máu ngoại vi thì chống đông bằng EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid). Mẫu bệnh phẩm đảm bảo chất lượng là mẫu bệnh phẩm không đông vón và không lâu quá 1 giờ sau khi lấy khỏi tĩnh mạch hoặc sau khi rã đông.

Tiến hành kỹ thuật

Đếm số lượng bạch cầu có trong mẫu thử, pha loãng mẫu thử về nồng độ 10×10⁹ tế bào/lít, ghi lại hệ số pha loãng (số lần pha loãng).

Lấy 100 ul mẫu thử đã pha loãng cho vào các ống 1, 2 và 3.

Thêm 20 µl 7AAD vào cả 3 ống 1, 2, 3.

Thêm 20 µl CD45 – FITC/CD34 – PE vào ống 1 và ống 2.

Thêm 20 µl Control (CD45 – FITC/Isotype PE) vào ống số 3.

Votex đều các ống và ủ nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng.

Thêm 2000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng 10 phút.

Ngay lập tức thêm 100 ul huyền dịch hạt tham chiếu vào các ống 1, 2, 3.

Trộn lắc đều các ống.

Phân tích flow cytometry bằng chương trình đếm CD34 có sẵn trên máy flow cytometry.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Đọc kết quả

Kết quả do chương trình máy tính tự động xuất ra dưới dạng chỉ số CD34%, số đếm CD34 tuyệt đối (tế bào/ µl).

Nhận định kết quả

Nếu kết quả thu được giữa ống 1 và ống 2 khác nhau dưới hoặc bằng 10% thì kết quả chấp nhận tốt. Nếu khác biệt trên 10% cần phải làm lại xét nghiệm, phải chú ý thực hiện thật tốt kỹ thuật hút mẫu và hút hóa chất bằng pipet.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

Đặt nhầm vị trí giữa mẫu chứng âm (Isotype Control) với các mẫu thử.

Xử trí: kiểm tra đối chiếu vị trí đặt ống đúng thứ tự trước khi phân tích

Máy chỉ cho ra kết quả CD34%, không tính ra được kết quả tế bào CD34/ µl. Thường do quên không nhập trị số nồng độ hạt tham chiếu vào phần mềm.

Xử trí: Chạy máy phân tích lại (không cần ủ lại mẫu), kiểm tra xác định đã nhập trị số nồng độ hạt tham chiếu trước khi phân tích trên máy.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Beckman Coulter. 2011. Haematopoietic Stem Cell CD34+ Enumeration Kit Instruction Manual.