Định loại sán lá gan lớn (giống fasciola) ỏ người và gia súc bằng chỉ thị adn

Đối chiếu, so sánh và phân tích trình tự ADN của 2 mẫu sán thu từ người và 4 mẫu có sai khác hình thái ngoài thu từ bò vùng Bình Định với các trình tự tương đồng của Fasciola ở một số’ nước nam Á và thế’ giới cho kết quả: các mẫu sán lá gan lớn ở người và bò đều thuộc loài F. gigantica, và lần đầu tiên loài sán này được xác nhận ký sinh ở người Việt Nam. Quần thể F. gigantica ở Việt Nam và một số nước vùng nam Á, trừ Indonesia có mức độ tương đồng khá cao về cấu trúc di truyền. Khảo sát 1350 sán lá gan lớn thu thập từ trâu, bò ở vùng Bình Định, Khánh Hoà đã tìm thấy 3 nhóm hình thái ngoài của chúng là nhóm giống F. hepatica, nhóm trung gian giữa F. hepatica và F. gigantica và nhóm F. gigantica. Dùng phản ứng PCR đặc hiệu loài F. gigantica để phân tích các nhóm hình thái này cho kết quả chúng đều là F. gigantica, chứng tỏ mức độ biến dị hình thái ngoài của F. gigantica là rất lớn. Kết quả cũng cho thấy quần thể sán lá gan lớn thu được từ trâu, bò ở vùng Bình Định, Khánh Hoà thuộc loai F. gigantica và khả năng tồn tại quần thể F. hepatica ở vùng này là rất thấp. Ngoài ra, còn phát hiện được một biến thể Redia con của F. gigantica có chứa nhiều cercaria hơn loại thông thường.

 
chứng xác đáng về mạt định loại [3]. Cho đến nay vần chưa có công trình nào nghiên cứu sâu về mạt phân loại học đối với F. hepatica và hẩu như không có cơ sở nghiên cứu nào lưu giữ mầu của loài này.
Trong vài năm gẩn đây, đã có hàng trăm bệnh nhân mắc bệnh sán lá gan lớn được ghi nhận, chủ yếu ở miền Trung nước ta và có thể có hàng chục nghìn người ở Việt Nam bị nhiễm sán này nhưng chưa được phát hiện. Sán lá gan lớn, nhất là F. gigantica, chưa thích nghi hoàn toàn với đời sống ký sinh ở người và một số động vật khác, nên tỉ lệ sán phát triển đến trưởng thành rất thấp. Hơn nữa thời gian sán phát triển đến truởng thành cũng khá dài và là thời kỳ gây bệnh tích nạng cho vật chủ. Vì vậy phương pháp chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn qua tìm trứng sán là không thích hợp. Hiện tại,
các phương pháp chẩn đoán bênh sán lá gan lớn trên cơ sở phản ứng miễn dịch là duy nhất thích hợp cho các trường hợp trên. Vấn đề quan trọng hàng đẩu là phải xác định chính xác loài sán gây bênh để có các chẩn đoán miễn dịch đạc hiệu và tạo cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để phòng trị bệnh sán lá gan lớn cho cả người và gia súc.
Phương pháp phân loại, giám định sinh vật dựa trên trình tự ADN của bô gen ty thể (mitochondrial DNA- mtDNA) và phản ứng PCR (polymerase chain reaction) đạc hiệu đang được dùng phổ biến. Lợi thế của phương pháp là cho kết quả có đô tin cậy cao, cẩn ít vật mầu và không phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cá thể của sinh vật, nên rất phù hợp cho giám định loài sán lá gan lớn ký sinh ở người [8; 9]. Mạc dù thu mầu sán lá gan lớn ở người hết sức khó khăn, nhưng bệnh sán lá gan lớn là bệnh lây truyền giữa người và động vật, chủ yếu là trâu, bò, do đó việc xác định loài sán lá gan lớn ở các gia súc này sẽ là các bằng chứng gián tiếp về loài sán ký sinh ở người.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kết hợp cả hai phương pháp trên, nhằm mục đích đảm bảo độ tin cậy cao của các kỹ thuật mới và tính hiệu quả khi khảo sát số lượng mầu lớn.
II.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu
1.    Đối tượng:
Mầu vật sử dụng trong phương pháp phân tích trình tự ADN bao gồm: F.hC là F. hepatica thu được từ nước úc (ảnhl, F.hC), F.sp1 và F.sp2 thu được từ bệnh nhân, trong đó F.sp1 là cá thể sán non, F.sp2 gồm hơn 200 trứng có cấu tạo của trứng sán giống Fasciola, thu được tại tỉnh Bình Định. Các mầu F.sp3, F.sp4, F.sp5 và F.sp6 là các cá thể sán lá gan lớn thu từ bò ở tỉnh Bình Định, trong đó F.sp3 và F.sp4 có hình thái ngoài điển hình của F. gigantica (ảnh1, nhóm F.g), F.sp5 và F.sp6 có hình thái ngoài trung gian giữa F. hepatica và F. gigantica (ảnhl, nhóm F.hg). Các tiêu bản được định hình trong cồn 90%, trừ tiêu bản trứng sán (F.sp2) được định hình sau khi nuôi đến giai đoạn Miracidium. Mầu sán lá gan lớn sử dụng trong phương pháp chẩn đoán phân biệt F. hepatica và F. gigantica bằng kỹ thuật PCR đạc hiệu, được thu từ trâu, bò vùng Bình Định, Khánh Hoà. Để sán chết tự nhiên trước khi định hình trong cồn 70%, nhằm tránh biến dạng hình thái ngoài của mầu vật. Redia con của F. gigantica thu từ ốc Lymnaea ở tỉnh Bình Định.
2.    Phương pháp:
2.1. Phương pháp phân tích trình tự ADN: Cạp mồi (primer) được thiết kế để nhân bản đoạn ADN dài 518 bp (base pair) của gen cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) trong hệ gen ty thể của cả F. hepatica và F. gigantica. Ký hiệu và trình tự cạp mồi là FF- TGGTTTTTTGGGC ATCCTGAG và FR- ATAACCAGTCACAACAGGCCAC. ADN tổng số (total DNA) được tách chiết bằng bộ hoá chất QIAamp blood and tissue Kit (QIAGEN Inc.) theo qui trình của nhà sản xuất. ADN đích đã được nhân bản bằng PCR tiêu chuẩn với bộ hoá chất GeneAmp® PCR Reagent Kit (Perkin- Elmer). Chu trình nhiệt của PCR trên máy PTC 100 (MJ. Research Inc., Mỹ) gồm bước biến tính ở 940C – 3 phút, tiếp theo 35 chu kỳ: 940C – 1 phút, 500C – 1,5 phút và 720C – 1 phút, chu kỳ cuối kéo dài 5 phút ở 720C. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR purification kit (QIAGEN Inc.) và được giải trình trực tiếp sợi đôi ADN với cả 2 mồi PCR, nhằm thu được kết quả chính xác. Giải trình tự được tiến hành với bộ hoá chất FS-DNA sequencing kit theo qui trình của nhà sản xuất và máy tự động ABI 377 PRISM (Perkin Elmer). Đối chiếu các trình tự thu được với các trình tự tương đồng từ một số quẩn thể sán Fasciola đã được nhiều tác giả trên thế giới công bố trong ngân hàng