ĐỊNH LƯỢNG GEN BỆNH MÁU ÁC TÍNH BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

QUANTITATIVE REAL – TIME PCR OF GENES INVOLVED IN

MALIGNANT HEMATOPOIETIC DISEASES

 

NGUYÊN LÝ

Sử dụng phương pháp Real – time – PCR định lượng ARNm của gen ung thư nhằm mục đích dự đoán thời điểm bệnh tái phát để ngăn chặn trước khi tái phát. Dựa trên sự kiểm soát lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng có thể xác định số lượng ARNm của gen ung thư tại thời điểm đó. Đồng thời trong phản ứng định lượng cùng lúc 2 gen: gen ung thư cần theo dõi và gen tham chiếu (housekeeping gen – là gen có tốc độ biểu hiện như nhau ở cả tế bào ung thư và tế bào lành) sẽ cho phép đánh giá mức độ hoạt động của gen ung thư so với gen tham chiếu ở cùng một thời điểm trong toàn bộ quá trình theo dõi thông qua tỷ lệ số lượng ARNm của gen ung thư/số lượng ARNm gen tham chiếu. Số lượng ARNm của gen ung thư tăng dần là đấu hiệu gen ung thư bắt đầu hoạt động trở lại.

CHỈ ĐỊNH

Xét nghiệm này được chỉ định trước và trong suốt quá trình điều trị cho các người bệnh đang điều trị theo phác đồ nhắm đích.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo  

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Hệ thống máy real – time PCR

Tủ hút hóa chất (chemical fume hood)

Buồng vô trùng (biology cabinet).

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút).

Máy vortex.

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl.

Đầu côn có màng lọc.

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.

Tủ lạnh 4 – 8⁰C, tủ âm sâu – 20⁰C.

Găng tay.

Hóa chất

Dung dịch Ficoll hoặc dung dịch ly giải tế bào hồng cầu gồm các muối MgCl2, Tris – HCl, NaCl.

Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.

Hóa chất cho phản ứng định lượng biểu hiện gen: kit thương mại. Nếu không sử dụng kit thương mại thì sử dụng các thành phần riêng lẻ như: Đệm, MgCl₂, dNTPs, enzym phiên mã ngược, enzym kéo dài chuỗi, mồi oligodT hoặc mồi ngẫu nhiên (random primer), các cặp mồi và probe đặc hiệu, nước khử ion vô trùng.

Bệnh phẩm

2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

2 ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA

Tiến hành kỹ thuật

Bước 1: Tách chiết ARN

Xem bài “Tách chiết ARN từ máu ngoại vi/tủy xương

Bước 2: Thực hiện phản ứng ADNc

Sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotit (random hexamer primers) và enzym Reverse Transcriptase để chuyển hóa ARN thành ADN thông qua các chu trình nhiệt chuyên biệt.

Bước 3: Thực hiện phản ứng real – time PCR

Chuẩn bị các mẫu chuẩn:

Mỗi loại gen cần định lượng phải có tối thiểu 3 mẫu chuẩn (mẫu chuẩn là các mẫu ARN đích đã biết trước nồng độ, thường sử dụng mẫu chuẩn ở 3 độ pha loãng liên tiếp) và một mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm (thường sử dụng H₂0 đã khử các enzym phân hủy ADN và ARN hoặc đệm Tris – EDTA 1M, pH=7,5).

Chuẩn bị phản ứng:

Ghi tên các ống theo thứ tự.

Mỗi ống phản ứng bổ sung đủ các thành phần phản ứng:

+ Sản phẩm ADNc + master mix theo nồng độ khuyến cáo (nếu sử dụng kit định lượng chế tạo sẵn).

+ Sản phẩm ADNc + buffer+ enzym+ primer+ probe theo đúng nồng độ đã tối ưu (nếu sử dụng các thành phần riêng lẻ).

Đặt các ống phản ứng vào các vị trí trên máy.

Chuẩn bị chương trình trên máy

Cài đặt sơ đồ giếng theo đúng các vị trí ống đã đặt trên máy, nhập thông tin mẫu và các nồng độ mẫu chuẩn theo đúng yêu cầu, chọn kênh màu huỳnh quang tương thích.

Cài đặt chương trình chạy theo chế độ luân nhiệt khuyến cáo của kit hoặc chế độ luân nhiệt đã tối ưu được.

Chọn vị trí lưu kết quả sau khi kết thúc chương trình chạy.

Bấm start để bắt đầu chạy theo chương trình đã chọn.

Bước 4: Phân tích kết quả

Sau khi kết thúc chương trình chạy, tất cả các kết quả được hiển thị lên màn hình.

Kiểm tra các đường chuẩn và mẫu đối chứng âm trước.

+ Nếu đạt yêu cầu (theo hướng dẫn của kit sử dụng hoặc theo kết quả lý thuyết đã tối ưu) thì tiếp tục phân tích các mẫu khác theo kết quả thu được.

+ Nếu không đạt yêu cầu (mẫu chuẩn không có tín hiệu huỳnh quang, mẫu đối chứng âm bị nhiễm thành dương tính….) thì không đủ cơ sở để phân tích các mẫu khác. Trong trường hợp này phải lặp lại xét nghiệm sau khi đã tìm ra nguyên nhân sai sót ở xét nghiệm trước.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Nhận định kết quả theo các kết quả thu được bằng cách tính toán tỷ lệ ARNm gen ung thư/ ARNm gen tham chiếu.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT	XỬ TRÍ
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.	Thực hiện đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
Thao tác pipet không chính xác.	Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.	Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phạm Hùng Vân (2009). Real – time PCR. PCR và Realtime PCR – các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản y học, trang 60 – 65.

J Gabert et at (2003). Standardization and quality control studies of “realtime” quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – A Europe Agains Cancer . Leukemia 17, 2318 – 2357.