ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG nDNA BẰNG

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA)

(Anti – nDNA quantitative test by ELISA)

 

NGUYÊN LÝ

Kháng nguyên nDNA được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu anti – nDNA IgG – IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên – Kháng thể đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên – Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên – Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H₂O₂ . Enzym peroxidase trong giếng phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H₂O₂ và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a – xít H₂SO₄ loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.

CHỈ ĐỊNH

Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy ly tâm ống máu.

Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.

Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động).

Găng tay.

Hóa chất

Kít định tính nDNA IgG/IgM gồm các thành phần sau:

Dung dịch pha loãng mẫu;

Dung dịch rửa;

Chứng âm (negative control);

Chứng dương (positive control);

Chứng ngưỡng (cut – off calibrator);

Các nồng độ kháng thể chuẩn (calibrator): thường có 6 nồng độ chuẩn, giá trị cụ thể của các ống nồng độ chuẩn tùy thuộc vào hãng sản xuất;

Dung dịch cộng hợp (conjugate): 1 lọ cộng hợp gồm cả IgG và IgM dùng để phát hiện kháng thể IgG và IgM;

Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);

Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);

Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA;

Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

Mẫu bệnh phẩm

Mẫu dùng là huyết thanh;

Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng;

Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm;

Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2^oC đến 8^oC có thể dùng làm xét nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu (≤ – 20^oC). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông – tan nhiều lần.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu (cung cấp theo kít).

Nhỏ 100µl các nồng độ chuẩn (calibrator), mẫu chứng âm, chứng dương, các mẫu thử vào các giếng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.

Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.

Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) vào các giếng.

Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.

Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.

Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.

Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.

Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.

Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép 450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.

Phân tích kết quả.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Căn cứ vào nồng độ chuẩn ghi trên các ống calibrator và mật độ quang đo được (chỉ số OD), nhập số liệu vào chương trình Exel để tính nồng độ kháng thể kháng nDNA (IgG và IgM) trong các mẫu thử.

Giá trị biện luận: Tốt nhất phải căn cứ vào các hướng dẫn biện luận và đơn vị tính đã được chuẩn hóa chất lượng của nhà sản xuất kít. Một trong những kít nDNA tốt và phổ biến trên thị trường có thông số biện luận như sau:

+ Ngưỡng bình thường:

+ Ngưỡng nghi ngờ: từ 12 – 18 U/ml;           

+ Ngưỡng dương tính: > 18 U/ml.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông;

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.

Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.

Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính: Nếu xảy ra hiện tượng này đều không dùng được kết quả của lần xét nghiệm này. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.

Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25 – 30^oC).

 

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Aesku Diagnostics GmbH. 2007. AESKULISA nDNA instruction manual.