Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng multiplex-PCR xác định kiểu gen CagA và VacA của Helicobacter pylori gây bệnh lý dạ dày
Vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori) là nguyên nhân chính gây bệnh lý dạ dày và là một yếu tố nguy cơ sớm phát triển ung thư dạ dày. Gần đây, các gen CagA và VacA của H. pylori đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh bệnh lý dạ dày. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng multiplex-PCR để phát hiện và phân biệt kiểu gen CagA và VacA-(s1/s2, m1/m2) của H. pylori. Độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng multiplex-PCR là 100% và ngưỡng phát hiện là 10-6 ng ADN plasmid.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1.Đối tượng nghiên cứu.
*Vi khuẩn:
30 chủng H. pyloriđược phát hiện từ các mẫu sinh thiết của bệnh nhân (BN) loét dạ dày (15 BN) và ung thư dạ dày (15 BN) thu thập tại Bệnh viện 103 và Bệnh viện TWQĐ 108 bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và ure test. Sử dụng các chủng H. pylori làm Tách dòng (cloning) gen VacA và CagA, làm mẫu chuẩn để đánh giá độ nhạy của phản ứng. 30 chủng chuẩn gồm 24 chủng V. cholerae phân lập từ BN tả, 6 chủng chuẩn Salmonella typhi, Salmonella typhi A, Salmonella typhi B, Salmonella typhi C và E. coli được sử dụng để đánh giá độ đặc
hiệu của kỹ thuật và làm chứng âm.
*Tế bào khả biến:
Tế bào khả biến E. coli dòng DH5a dùng tách dòng (cloning) các đoạn gen VacA và CagA của H. pylori phân lập từ BN bị bệnh lý dạ dày.
2.Phương pháp nghiên cứu.
*Tách và tinh sạch ADN vi khuẩn từ mảnh sinh thiết dạ dày:
Lấy một mẫu nhỏ mảnh sinh thiết đem nghiền cùng với 500 ụl dung dịch PBS bằng chày trong ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó, hút lấy phần dung dịch lỏng chứa mô nghiền để tách ADN ngay hoặc lưu mẫu – 20°C đến khi sử dụng. Tách và tinh sạch ADN, sử dụng phương pháp dùng Clorofom- Phenol-Isoamyl (25:24:1). Quy trình theo thường quy tại phòng thí nghiệm và hướng dẫn của nhà sản xuất. ADN tổng số sau khi tách, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN, dùng hệ thống quang phổ Nano Drop tại
Trung tâm Sinh-Y-Dược học quân sự, Học viện Quân y.
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất