Đột biến gen cyp21a2 và mối tương quan giữa kiều gen – kiều hình của bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu 21-hydroxylase

19 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩn sinh do thiếu 21-hydroxylase được nghiên cứu phát hiện đột biến gen CYP21A2 và đánh giá mối tương quan giữa kiểu gen-kiểu hình; sử dụng các kỹ thuật PCR, giải trình tựgen và MLPA. Kết quả 100% bệnh nhân TSTTBS có đột biến gen CYP21A2 và 14/15 (93,3%) bệnh nhân có mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình gồm 3 bệnh nhân bị đột biến đồng hợp tử I172N ở thể nam hóa đơn thuần, 4 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử IVS2-13A/C>G và 7 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tửmất đoạn lớn ở thể mất muối.

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm các bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể, đặc trưng bởi sự thiếu hụt tổng hợp cortisol vỏ thượng thận. Khoảng 95% các trường hợp do thiếu hụt enzym 21-hydroxylase (21-OH), gây thiếu cortisol kèm theo (hoặc không) thiếu hụt aldosterone và tăng tiết androgen thượng thận. Biểu hiện lâm sàng của bệnh gồm hai thể: thể nặng (thể cổ điển) và thể nhẹ hơn (không cổ điển). Thể cổ điển có tỷ lệ mới mắc 1/10.000 đến 1/16.000 trẻ đẻ sống đối với hầu hết các chủng tộc và được chia thành thể mất muối (MM) và thể nam hóa đơn thuần (NHĐT) [5;11].
Gen mã hóa 21-OH (CYP21A2) cùng với giả gen (CYP21A1P) nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), nằm bên trong phức hợp kháng nguyên bạch cầu người, cách nhau khoảng 30 kb, gần kề và xen kẽ với các gen C4A và C4B mã hóa thành phần C4 bổ thể. Gen CYP21A2 và CYP21A1P gồm 10 exon, có kích thước 3,4 kb. Hai gen này có trình tự nucleotid tương đồng nhau 98% ở vùng exon và 96% ở vùng intron. Đột biến gây thiếu hụt 21-OH là do sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể trong quá trình tphân bào giảm nhiễm, các trình tự ở vùng gen giả sẽ chuyển sang gen CYP21A2 và dẫn đến các đột biến gây bệnh. Hiện tượng tái tổ hợp trong gen chiếm khoảng 95% các đột biến gây thiếu hụt 21-OH, trong đó khoảng 75% các đột biến bình thường có mặt tại giả gen và khả năng được chuyển sang gen chức năng [5 ;11]
Ở Việt Nam, tỷ lệ mới mắc của TSTTBS chưa được xác định do chương trình sàng lọc sơ sinh chưa được triển khai có hệ thống, tuy nhiên theo số liệu của bệnh viện Nhi Trung ương, mỗi năm có 40 đến 60 trường hợp mới được chẩn đoán và điều trị. Tính đến tháng 8/2011, tại Khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền, bệnh viện Nhi Trung ương có khoảng 580 bệnh nhân TSTTBS được chẩn đoán và điều trị, trong đó 98% trường hợp do thiếu 21-OH. Tuy nhiên, những nghiên cứu về kiểu gen gây bệnh TSTTBS trên trẻ em Việt Nam còn nhiều hạn chế. Việc phát hiện đột biến gen gây bệnh TSTTBS là cần thiết, nhằm: i) khẳng định chẩn đoán và cho phép điều trị sớm, phòng tránh được cơn suy thượng thận cấp cho những trường hợp có kết quả xét nghiệm hormon không rõ ràng; ii) xác định người lành mang gen phục vụ tư vấn di truyền; iiì) chẩn đoán và điều trị trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng và làm giảm tình trạng nam hóa chuyển giới gây mơ hồ giới tính sau sinh; iv) áp dụng các liệu pháp điều trị mới và liều lượng steroid thay thế trên cơ sở mối tương quan kiểu gen – kiểu hình, do đó hạn chế hậu quả ức chế tăng trưởng trên bệnh nhân khi sử dụng quá liều streroid thay thế [1].
Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: Xác định đột biến gen CYP21A2 và tìm hiểu mối tương quan giữa kiểu gen – kiểu hình ở bệnh nhân TSTTBS do thiếu hụt 21 – OH tại Việt Nam.
II.    ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.    Đối tượng nghiên cứu
-19 bệnh nhân (7 nam; 12 nữ) được chẩn đoán mắc bệnh TSTTBS do thiếu 21-OH (tuổi chẩn đoán từ 22 giờ tuổi đến 65 tháng tuổi) tại khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương.
2.1.    Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
–    Lâm sàng: trẻ gái (46, XX) có biểu hiện nam hóa lúc sinh hoặc xuất hiện nam hóa sau sinh; trẻ trai có biểu hiện nam hóa (dậy thì sớm); trẻ có cơn suy thượng thận cấp, mất muối trong 4 tuần đầu sau sinh; gia đình chấp nhận phân tích đột biến gen.
–    Xét nghiệm hóa sinh:    nồng    độ
17-hydroxyprogesterone (17-OHP) huyết thanh >20.000 ng/dL ở thể cổ điển và >2.000 đến 15.000 ng/dL ở thể không cố điển; điện giải đồ máu: Na+ hạ và K+ tăng.
–    Phân loại kiểu hình (phenotype): dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và hóa sinh [6].
2.    Phương pháp nghiên cứu
2.1.    Phân tích đột biến của gen CYP21A2
–    Chiết tách DNA: Các đối tượng nghiên cứu được lấy 2 ml máu tĩnh mạch, chống đông bằng EDTA. DNAđược chiết tách từ bạch cầu lympho máu ngoại vi theo quy trình phenol/ chloroíorm. Mẫu DNAđược đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano – Drop, những mẫu DNAđạt tiêu chuẩn OD28Ũ/OD26Ũ >1,8 được sử dụng để phân tích gen.
–    Kỹ thuật PCR: sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ chiều dài gen CYP21A2. Thành phần phản ứng PCR: tổng thể tích 20ml gồm: 100^150ng DNA, 5pmol primer, 200 ụ mol/l dNTP, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2ụl GeneAmp 10x buffer. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94°C/5 phút, [940c/1 phút, 60°c/1 phút, 720C/1 phút] X 35 chu kỳ, 72°C/2 phút, giữ ở 150c.
–    Kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing): Được thực hiện theo quy trình thường quy. Kết quả được phân tích và so sánh với dữ liệu từ GeneBank
–    Kỹ thuật MLPA được thực hiện theo quy trình đã được mô tả trước đây [3]
2.2.    Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen – kiểu hình
–    Quá trình phân tích gen CYP21A2 được tiến hành độc lập với quá trình theo dõi và đánh giá lâm sàng để xác định thể mất muối, thể nam hóa đơn thuần hay thể không cổ điển. Kết quả phân tích đột biến gen CYP21A2 được đối chiếu với thể lâm sàng của từng bệnh nhân để xác định mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình.