Giá trị của kỹ thuật pcr khuyếch đại vùng gen d1/d2 trong chẩn đoán nhanh viêm loét giác mạc do nấm

Viêm loét giác mạc nhiễm trùng là bệnh lý hàng đầu gây mù lòa trong số các bệnh lý giác mạc. Căn nguyên gây viêm loét giác mạc rất đa dạng, có thể do vi khuẩn, nấm, virus hoặc có thể kết hợp của các căn nguyên này [8]. Thực tế, trong vài thập kỷ gần đây, tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm gia tăng một cách đáng quan ngại, chiếm tới 16 – 37% các trường hợp viêm loét giác mạc [7]. Chẩn đoán được sớm loại căn nguyên gây viêm loét giác mạc rất có ý nghĩa cho việc bắt đầu ngay quá trình điều trị tấn công đặc hiệu, giúp chữa khỏi hoặc giảm thiểu tối đa sự hình thành sẹo giác mạc [2]. Kỹ thuật PCR chẩn đoán căn nguyên nấm viêm loét giác mạc có tính ưu việt hơn nhiều so với phương pháp chẩn đoán kinh điển bằng nhuộm soi và nuôi cấy [4]. Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật semi – nested PCR khuyếch đại đoạn gen ITS để phát hiện nấm trong bệnh phẩm chất nạo giác mạc [1]. Tuy vậy, khi áp dụng cho chẩn đoán thường qui các bệnh phẩm lâm sàng, kỹ thuật nested PCR có những nhược điểm đáng phải cân nhắc. Đó là thời gian chẩn đoán phải kéo dài do thực hiện hai phản ứng PCR và nguy cơ dễ bị nhiễm DNA khi thường xuyên phải thao tác với các sản phẩm PCR đã được khuyếch đại [3, 9]. Với mong muốn áp dụng được kỹ thuật PCR đơn để chẩn đoán hiệu quả các mẫu bệnh phẩm lâm sàng, vùng gen D1/D2 nằm ở gần đầu 5 của gen mã hóa cho tiểu phần 28S của rRNA đã được lựa chọn làm gen đích. Chúng tôi tiến hành cứu với mục tiêu:

Đánh giá giá trị của kỹ thuật PCR khuyếch đại vùng gen D1/D2 phát hiện căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc.

I. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

– 10  chủng  nấm  thuộc  các  loài   Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Fusarium sp.

– Các chủng vi khuẩn có khả năng gây  viêm loét    giác    mạc    bao    gồm     Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, và tế bào bạch cầu người được sử dụng như chứng (-) để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi dùng xác định nấm.

– Bệnh phẩm chất nạo giác mạc của 20 bệnh nhân được chẩn đoán hoặc nghi viêm  loét giác mạc do nấm, và 2 bệnh phẩm của  bệnh nhân được chẩn đoán viêm loét giác mạc do vi khuẩn tại bệnh viện Mắt Trung ương. Bệnh phẩm được lấy theo quy trình thường qui  tại bệnh viện Mắt Trung ương. 100 µl dung dịch NaCl 0,9% sau khi rửa tiêu bản đã soi  tươi được chuyển vào ống eppendorff để tách chiết DNA cho PCR.

2. Phương pháp nghiên cứu

– Kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy phân  lập nấm được thực hiện tại Labo Vi sinh, viện Mắt Trung ương.

– Qui trình tách chiết DNA và PCR được thực hiện tại khoa Vi sinh, Đại học Gifu, Nhật Bản.

+ DNA được tách chiết bằng kít MORA (AMR, Gifu, Japan).

+ PCR sử dụng cặp mồi NL1 (5 – GCATAT- CAATAAGCGGAGGAAAAG – 3) và NL4 (5 – GGTCCGTGTTTCAAGACGG – 3) và chu trình nhiệt có được thay đổi (950C/5 phút ; 40 chu kỳ gồm 950C/30giây, 550C/60 giây, và 720C/60 giây, kết thúc bằng 720C/6 phút) so với mô tả của Kurtzman và cộng sự để khuyếch đại đoạn dài khoảng 600 bp (vùng gen biến đổi D1/D2) nằm sát đầu tận 5 của gen mã hóa cho tiểu phần lớn rRNA (LSU rRNA) [6]. Tất cả các lần làm PCR với bệnh phẩm luôn luôn có chứng âm và chứng dương chạy cùng để loại trừ hiện tượng âm tính và dương tính giả.

+ Để đánh giá và so sánh độ nhạy của PCR

khuyếch đại vùng gen D1/D2 và PCR khuyếch đại vùng gen ITS, DNA của chủng nấm Aspergillus fumigatus được pha loãng bậc 10 giảm dần từ 50 ng đến 50 fg làm khuôn mẫu.

+ Quy trình PCR khuyếch đại ITS theo mô tả của Ferrer và cộng sự [4]