Giá trị của kỹ thuật pcr trong chẩn đoán vi khuẩn lậu

Bênh lậu là một trong những bênh lây truyền qua đường tình dục do vi khuẩn Neisseria gonorrhoeae gây nên. Bênh nhân ở nước ta sử dụng kháng sinh tuỳ tiên nên các phương pháp chẩn đoán thông thường như nhuộm soi, nuôi cấy thường là không phát hiên được vi khuẩn trong những trường hợp này. Việc áp dụng kỹ thuật mới có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với các phương pháp cổ điển là cẩn thiết để đánh giá đúng hơn về tình hình nhiễm vi khuẩn lậu hiên nay. Phương pháp được dùng phổ biến hiên nay là kỹ thuật PCR. Mục tiêu: 1. Xác định tỷ lê nhiễm vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR trên những bênh nhân có hội chứng tiết dịch niêu đạo và âm đạo. 2. So sánh tỷ lê hiên mắc bênh lậu bằng các kỹ thuật: PCR, nuôi cấy và nhuộm soi. Đối tượng và phương pháp: Đối tượng là 100 bênh nhân có hội chứng tiết dịch niêu đạo, âm đạo được chúng tôi tiến hành song song 3 kỹ thuật: Soi trực tiếp, nuôi cấy và PCR. Kết quả: – Tỷ lê nhiễm vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR: 27%. – Tỷ lê hiên mắc bênh lậu bằng các kỹ thuật: PCR là 27% trong khi đó nuôi cấy phân lập là 16% và nhuộm soi chỉ là 13%.
Từ khóa: Lậu cẩu, PCR, Viên Da liễu Quốc Gia.
I. ĐẶT VẤN ĐỂ
Bênh lậu là một trong những bênh lây truyền qua đường tình dục do vi khuẩn Neisseria gonorrhoeae gây nên [3]. Vi khuẩn lậu ngoài gây viêm niêu đạo, chúng còn có khả năng gây viêm kết mạc, nhất là viêm kết mạc mắt ở trẻ sơ sinh, viêm khớp, hội chứng Reiter và những biến chứng ngoài tiết niêu sinh dục. Bênh nhân ở nước ta sử dụng kháng sinh bừa bãi, số người bị bênh lậu không có triêu chứng chiếm 70% [4]. Các phương pháp chẩn đoán thông thường như nhuộm soi, nuôi cấy chỉ phát hiên được tỷ lê rất thấp. Hiên nay trên thế giới có rất nhiều kỹ thuật mới được ứng dụng trong chẩn đoán các bênh nhiễm khuẩn nói chung và bênh lậu nói riêng, trong đó có kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Viêc áp dụng kỹ thuật mới PCR có độ nhạy và độ đặc hiêu cao hơn nhiều so với các kỹ thuật cổ điển là viêc làm rất cẩn thiết để đánh giá chính xác về tình hình nhiễm vi khuẩn lậu hiên nay. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu:
1.    Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR trên những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo và âm đạo.
2.    So sánh tỷ lệ hiện mắc vi khuẩn lậu bằng các kỹ thuật: PCR, nuôi cấy và nhuộm soi.
II.    ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứư:
2.1.    Đối tượng: là 100 bênh nhân có hội chứng tiết dịch niêu đạo và âm đạo được    chúng    tôi    tiến
hành đổng thời 3 kỹ thuật: kỹ thuật nhuộm soi, kỹ thuật nuôi cấy và kỹ thuật PCR.
2.2.    Bênh phẩm: mủ hoặc dịch tiết của niêu đạo, âm đạo.
2.3.    Các kỹ thuật xét nghiêm:
2.3.1.    Kỳ thuật nhuộm soi:
–    Niêu đạo: Dùng tăm bông vô trùng loại nhỏ đưa sâu vào niêu đạo từ 1,5-2cm rổi xoay nhẹ tăm bông, để từ 5 – 10 giây. Rút tăm bông một cách nhẹ nhàng và dàn bênh phẩm lên lam kính với vòng tròn có đường kính 7-10mm.
–    Cổ tử cung: Làm ẩm mỏ vịt bằng nước cất vô trùng, đặt mỏ vịt để bộc lộ cổ tử cung. Dùng tăm
bông vô trùng đưa sâu vào cổ tử cung 2-3cm, để 5-10 giây cho dịch ngấm vào tăm bông. Rút tăm bông ra một cách nhẹ nhàng và dàn bênh phẩm lên lam kính. Để bênh phẩm khô tự nhiên rổi hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cổn 2-3 lần sau đó tiến hành nhuộm Gram, để khô tự nhiên và soi trực tiếp dưới kính hiển vi quang học thấy vi khuẩn lậu là những song cầu hình hạt cà phê, hai mặt    dẹt    úp    vào
nhau, bắt màu Gram âm, nằm trong hay ngoài bạch cầu đa nhân trung tính [5].
2.3.2.    Kỳ thuật nuôi cấy vi khuẩn:
Kỹ thuật lấy bênh phẩm nuôi cấy, chúng tôi tiến hành như kỹ thuật lấy bênh phẩm soi trực tiếp [9]. Bênh phẩm được ria trên môi trường Thayer-Martin bằng những đường dích dắc hoặc cấy phân vùng. Để đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm nhiệt độ 35-36oC, 3-10%C02, độ ẩm >70%. Sau 18-24h nuôi cấy, quan sát sự nhân lên của vi khuẩn. Nếu chưa thấy vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa.
Kỳ thuật xác định vi khuẩn lậu:
Sau 18-24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn lậu có đường kính từ 0,5-1mm, tròn, bờ khuẩn lạc đều, lổi, nhày, óng ánh và có màu hơi xám.
Thực hiên 4 kỹ thuật để xác định vi khuẩn lậu: nhuộm Gram để xác định tính chất bắt màu và hình thể của vi khuẩn. Thử nghiêm Oxidase và Superosol để xác định giông Neisseria. Thử nghiêm phân hủy đường nhanh để xác định loài trong giông Neisseria. Vi khuẩn lậu chỉ phân huỷ đường glucose không phân phân huỷ các loại đường glucose, maltose, fructose và saccharose.
2.3.3.    Kỳ thuật PCR:
Bênh phẩm: Sử dụng tăm bông vô trùng lấy dịch tiết từ niêu đạo, cổ tử cung. Tăm bông bênh phẩm được giữ ở -70oC cho tới khi tách ADN.
Tách ADN: theo phương pháp dùng phenol/chloroform/isoamyl alcohol và kết tủa ADN bằng cổn tuyêt đôi.
Mổi xuôi: H01: 5′ GCA ACG CAT ACC CGC GTT GC 3′
Mổi ngược: H03: 5′ CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3′
(mổi xuôi H01 và mổi ngược H03 của hãng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản)
Cặp mổi này nhân lên một đoạn ADN dài 390 đôi bazơ của gen mã hoá