GIÁ TRỊ XÉT NGHIỆM Mp1p TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ DỰ BÁO NHIỄM NẤM Talaromyces marneffei Ở BỆNH NHÂN AIDS

Luận án tiến sĩ y học GIÁ TRỊ XÉT NGHIỆM Mp1p TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ DỰ BÁO NHIỄM NẤM Talaromyces marneffei Ở BỆNH NHÂN AIDS.Nhiễm HIV/AIDS vẫn còn là gánh nặng sức khỏe toàn cầu mặc dù đã có nhiều bước tiến trong chẩn đoán, điều trị và dự phòng kể từ khi vi rút HIV được phát hiện vào những năm 1980. Ước tính có khoảng 36,7 triệu người đang sống chung với HIV trên toàn thế giới, trong đó có gần 1 triệu trường hợp tử vong liên quan đến các nhiễm trùng cơ hội giai đoạn AIDS mỗi năm [51].
Góp phần làm tăng tỉ lệ tử vong này là bệnh lý nhiễm nấm Talaromyces marneffei (T.marneffei), đặc biệt được ghi nhận ở các quốc gia Châu Á, đứng hàng thứ 3 sau bệnh lao và bệnh do nấm Cryptococcus neoformans [81]. Đây là một bệnh lý nhiễm nấm toàn thân, dễ xảy ra khi bệnh nhân có số lượng TCD4+

Các yếu tố này dẫn đến việc chậm trễ chẩn đoán, chậm trễ điều trị, và mặc dù có thuốc điều trị kháng nấm, tỉ lệ tử vong có thể tăng đến 20% – theo tác giả Thuy Le và cs (2011) [108].
Chẩn đoán xác định nhiễm nấm T.marneffei dựa vào kết quả phân lập được tác nhân nấm trong máu, tại sang thương da, hạch bạch huyết hoặc từ các dịch cơ thể. Tuy nhiên, kết quả vi sinh thường chậm trễ và tỉ lệ phân lập thay đổi theo từng bệnh phẩm nên ảnh hưởng đến việc khẳng định chẩn đoán và kết quả điều trị. Một số nghiên cứu ghi nhận tỉ lệ phân lập T.marneffei trong máu và sang thương da lần lượt là 76% và 84% [99],[108]. Như vậy, có khoảng15-20% bệnh nhân nhiễm nấm T.marneffei không được nhận diện bằng các xét nghiệm bệnh phẩm thường quy. Đối với những trường hợp này, chẩn đoán xác định có thể dựa vào cấy tủy xương khi bệnh cảnh lâm sàng gợi ý, và theo tác giả Wong và cs (2011) tỉ lệ phân lập nấm trong tủy xương đạt 100% ở các bệnh nhân2 nhiễm T.marneffei. Tuy nhiên, chọc hút tủy xương là thủ thuật xâm lấn và chủ yếu chỉ thực hiện được ở các bệnh viện chuyên khoa huyết học [119].
Giải quyết các bất lợi này, các tác giả đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng nguyên nấm T.marneffei. Tác giả Desakorn V và cs dùng ELISA và ngưng kết hạt latex đo kháng nguyên T.marneffei trong nước tiểu từ năm 1999 [39]. Sau đó Panichakul T. và cs (2002) tại Thái lan, khi dùng phương pháp sandwich ELISA phát hiện kháng nguyên hòa tan T.marneffei dựa vào kháng thể đơn dòng (MAb-monoclonal antibody) cho thấy độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm lần lượt là 72%, 100%, 100% và 97% [83].
Gần đây hơn các tác giả sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử Taqman real time PCR để phát hiện gen Mp1 (Mannoprotein 1) – là gen mã hóa protein vách của T. marneffei [117] – từ các bệnh phẩm. Tuy vậy, các nghiên cứu cho thấy phương pháp này không giúp tăng khả năng chẩn đoán bệnh so với các kỹ thuật vi sinh thông thường, với độ nhạy từ 70% đến 77% và độ đặc hiệu 100% [56], [76]. Sự cải tiến về mặt kỹ thuật là sử dụng cùng lúc kháng thể đơn dòng MAb (Monoclonal Antibody) và kháng thể đa dòng PAb (Polyclonal Antibody) để phát hiện và nhận định đồng thời kháng nguyên và kháng thể Mp1p của T.marneffei từ nhóm tác giả Wang và cs (2011) tại Trung Quốc là bước đầu để lưu ý hơn về giá trị chẩn đoán của xét nghiệm này: độ nhạy 75%, độ đặc hiệu 99,4%, giá trị tiên đoán dương 83,3% và giá trị tiên đoán âm là 99,1% với ngưỡng cắt mật độ quang là 0,208 OD [117]. Kết quả này chưa thật sự đủ thuyết phục các nhà lâm sàng do cỡ mẫu của nghiên cứu này còn khá nhỏ (20 bệnh nhân nhiễm T.marneffei so với 549 trường hợp chứng). Tại Việt Nam, với nhu cầu cần có một kỹ thuật xét nghiệm giúp nhận diện sớm nấm T.marneffei nhằm khởi động điều trị kịp thời, tác giả N.T.M.Thu và cs (2017) đã sử dụng kỹ thuật này khảo sát hồi cứu trên 372 mẫu bệnh phẩm lưu trữ từ các bệnh nhân đã được khẳng định nhiễm T.marneffei qua cấy vi sinh, so sánh với 517 ca chứng không nhiễm loại nấm này. Kết quả đạt được là độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác lần lượt là 86%, 98% và 95%với điểm cắt là 0,5 OD, [18]. Xét nghiệm ELISA Mp1p với ngưỡng cắt này đã có thể được ứng dụng trên lâm sàng chưa? Yếu tố nào có liên quan đến nồng độ Mp1p? Chúng ta có thể phối hợp xét nghiệm ELISA Mp1p với các dữ liệu3 lâm sàng để có thể giúp xây dựng mô hình chẩn đoán T.marneffei sớm hay không? Với nghiên cứu hồi cứu này, các dữ liệu lâm sàng không đầy đủ và mẫu bệnh phẩm lưu trữ có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA. Giới hạn của đề tài trên gợi lên cho chúng tôi sự cần thiết thực hiện đánh giá lại độ chính xác của xét nghiệm, thực hiện tiền cứu cụ thể trên các bệnh nhân HIV/AIDS bị nhiễm T.marneffei, tìm hiểu các yếu tố liên quan đến giá trị xét nghiệm và đồng thời tìm cách xây dựng mô hình chẩn đoán phù hợp, từ đó góp phần xây dựng một chiến lược quản lý bệnh do nấm T.marneffei tốt hơn tại Việt nam.4
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
MỤC TIÊU TỔNG QUÁT
Xác định giá trị xét nghiệm Mp1p huyết thanh và nước tiểu trong chẩn đoán và theo dõi nhiễm nấm T.marneffei ở bệnh nhân AIDS có TCD4+ <100 tế bào/mm3.
MỤC TIÊU CỤ THỂ
1. Mô tả phân bố và các yếu tố liên quan đến nồng độ Mp1p trong huyết thanh và nước tiểu ở bệnh nhân AIDS có TCD4+ <100 tế bào/mm3.
2. Xác định giá trị chẩn đoán và giá trị dự báo nhiễm nấm T.marneffei của xét nghiệm ELISA Mp1p huyết thanh và nước tiểu ở bệnh nhân AIDS có TCD4+ <100 tế bào/mm3.
3. Xây dựng mô hình chẩn đoán nhiễm nấm T.marneffei dựa trên xét nghiệm ELISA Mp1p ở bệnh nhân AIDS có TCD4+ < 100 tế bào/mm

MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Danh mục chữ viết tắt v
Danh mục bảng viii
Danh mục hình x
Danh mục biểu đồ xi
Danh mục sơ đồ xii
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………………………………………..1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………………………5
1.1. Bệnh lý nhiễm HIV và hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) …………….5
1.2. Tình hình dịch HIV/AIDS tại Việt Nam………………………………………………………….5
1.3. Dịch tễ bệnh do nấm Talaromyces marneffei …………………………………………………..6
1.4. Đặc điểm vi nấm của Talaromyces marneffei…………………………………………………10
1.5. Cơ chế bệnh sinh của nấm T.marneffei………………………………………………………….14
1.6. Đặc điểm lâm sàng bệnh do nấm T.marneffei…………………………………………………20
1.7. Kỹ thuật chẩn đoán bệnh do nấm T.marneffei ………………………………………………..24
1.8. Điều trị bệnh do nấm Talaromyces marneffei…………………………………………………30
1.9. Tình hình nghiên cứu về giá trị xét nghiệm kháng nguyên Mp1p trong quản lý bệnh
do nấm T.marneffei trên bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS…………………………………32
1.10. Tổng quan về địa điểm nghiên cứu……………………………………………………………..36
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………37iii
2.1. Thiết kế nghiên cứu…………………………………………………………………………………….37
2.2. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………………………………….37
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu …………………………………………………………………38
2.4. Cỡ mẫu ……………………………………………………………………………………………………..38
2.5. Biến số và định nghĩa biến số trong nghiên cứu ……………………………………………..39
2.6. Kỹ thuật đo lường và phương pháp thu thập số liệu………………………………………..43
2.7. Quy trình nghiên cứu ………………………………………………………………………………….52
 Phương pháp phân tích số liệu ……………………………………………………………………..54
2.9. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu …………………………………………………………………56
Chương 3. KẾT QUẢ ……………………………………………………………………………………….57
3.1. Đặc điểm của mẫu nghiên cứu ……………………………………………………………………..58
3.2. Đặc điểm phân bố nồng độ Mp1p và xác định các yếu tố liên quan ………………….62
3.3. Xác định giá trị chẩn đoán nhiễm nấm T.marneffei của xét nghiệm ELISA Mp1p71
3.4. Xây dựng mô hình chẩn đoán bệnh do nấm T.marneffei ở bệnh nhân AIDS, TCD4
< 100 tế bào/mm3 ……………………………………………………………………………………77
Chương 4. BÀN LUẬN …………………………………………………………………………………….84
4.1. Đặc điểm của mẫu nghiên cứu ……………………………………………………………………..84
4.2. Đặc điểm phân bố nồng độ Mp1p và xác định các yếu tố liên quan ………………….91
4.3. Xác định điểm cắt của Mp1p trong chẩn đoán bệnh do nấm T.marneffei ở bệnh nhân
AIDS có TCD4+ <100 tế bào/ mm3 …………………………………………………………..96
4.4. Xây dựng mô hình chẩn đoán bệnh do nấm T.marneffei ở bệnh nhân AIDS, TCD4
< 100 tế bào/mm3 ………………………………………………………………………………….102iv
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………..108
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1. Phiếu thu thập số liệu
PHỤ LỤC 2. Phiếu công cấp thông tin và chấp thuận tham gia nghiên cứu
PHỤ LỤC 3. Phân bố Mp1p HT > 0,2 OD theo nơi cư ngụ trên 100.000 người nhiễm
HIV (n=78)
PHỤ LỤC 4. Đặc điểm của các trường hợp không tương hợp mp1p huyết thanh và nước
tiểu
PHỤ LỤC 5. Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu
PHỤ LỤC 6. Quyết định chấp thuận của hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
PHỤ LỤC 7. Quyết định phê duyệt đề tài cấp cơ

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn phân loại BMI…………………………………………………………………..40
Bảng 2.2. Tiêu chuẩn phân loại mức độ thiếu máu ……………………………………………….42
Bảng 2.3. Phân loại mức độ tương hợp theo chỉ số kappa ……………………………………..55
Bảng 3.1. Đặc điểm dân số – tiền căn liên quan HIV (n=533) ………………………………..58
Bảng 3.2. Đặc điểm lâm sàng của nhóm bệnh Talaromyces marneffei (n=70) …………61
Bảng 3.3. Đặc điểm cận lâm sàng của nhóm bệnh Talaromyces marneffei (n=70)……62
Bảng 3.4. Nồng độ Mp1p ở huyết thanh và nước tiểu ở nhóm bệnh nhân Tm (+) (n = 70)
……………………………………………………………………………………………………………………….62
Bảng 3.5. Nồng độ Mp1p ở huyết thanh và nước tiểu giữa 2 nhóm bệnh Tm (+) và
NTCH khác ……………………………………………………………………………………………………..64
Bảng 3.6. Phân bố Mp1p huyết thanh và nước tiểu theo vị trí phân lập của Tm ……….65
Bảng 3.7. Phân bố nồng độ Mp1p theo độ nặng của Tm (n = 70) …………………………..67
Bảng 3.8. Phân tích đơn biến các yếu tố liên quan đến nồng độ Mp1p huyết thanh (n =
533)…………………………………………………………………………………………………………………68
Bảng 3.9. Phân tích đa biến các yếu tố liên quan đến nồng độ Mp1p huyết thanh (n =
533)…………………………………………………………………………………………………………………69
Bảng 3.10. Phân tích đơn biến các yếu tố liên quan đến nồng độ Mp1p nước tiểu (n =
533)…………………………………………………………………………………………………………………70
Bảng 3.11. Phân tích đa biến các yếu tố liên quan đến nồng độ Mp1p nước tiểu (n = 533)
……………………………………………………………………………………………………………………….71
Bảng 3.12. Điểm cắt của Mp1p huyết thanh trong chẩn đoán bệnh do nấm T.marneffei
……………………………………………………………………………………………………………………….72ix
Bảng 3.13. Điểm cắt của Mp1p nước tiểu trong chẩn đoán bệnh do nấm T.marneffei.73
Bảng 3.14. So sánh diện tích dưới đường cong giữa 2 bệnh phẩm ………………………….74
Bảng 3.15. Giá trị chẩn đoán T.marneffei khi kết hợp Mp1p huyết thanh và nước tiểu (n
= 533) ……………………………………………………………………………………………………………..74
Bảng 3.16. Mức độ tương hợp giữa Mp1p huyết thanh và nước tiểu trong chẩn đoán
nhiễm nấm T.marneffei (n = 533) ……………………………………………………………………….75
Bảng 3.17. Thời gian phát triển T.marneffei hoặc tử vong của các trường hợp Mp1p ≥
0,2 OD, cấy âm tính trong thời gian nhập viện (n = 14)…………………………………………76
Bảng 3.18. Phân tích đơn biến các yếu tố liên quan đến nhiễm nấm T.marneffei (n=533)
……………………………………………………………………………………………………………………….78
Bảng 3.19. Phân tích đa biến các đặc điểm liên quan nhiễm nấm T.marneffei bằng
phương pháp Backward Wald (Bước 5) ………………………………………………………………78
Bảng 3.20. Phân loại đối tượng dựa theo quan sát và dự đoán (n = 533) …………………79
Bảng 3.21. Phân tích đơn biến các yếu tố liên quan đến nhiễm nấm T.marneffei (n=533)
……………………………………………………………………………………………………………………….81
Bảng 3.22. Phân tích đa biến các đặc điểm liên quan nhiễm nấm T.marneffei bằng
phương pháp Backward Wald (Bước 5) ………………………………………………………………81
Bảng 3.23. Phân loại đối tượng dựa theo quan sát và dự đoán (n = 533) …………………82
Bảng 4.1. Các tác nhân phân lập được trong máu của bệnh nhân nhiễm HIV…………..87
Bảng 4.2. Các đặc điểm lâm sàng phổ biến của bệnh nhân nhiễm nấm T.marneffei. ..88
Bảng 4.3. So sánh giá trị trung vị của Mp1p huyết thanh và nước tiểu ……………………92x
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các cột mốc quan trọng về diễn tiến dịch tễ bệnh do nấm T.marneffei……….7
Hình 1.2. Đặc điểm phân bố T.marneffei ở khu vực Đông Nam Á……………………………8
Hình 1.3. Các hình thái của nấm Talaromyces marneffei ………………………………………11
Hình 1.4. Mp1p tập trung trên thành tế bào T.marneffei dưới kính hiển vi điện tử miễn
dịch ở các hình dạng: hạt men (A), bào tử đính (B) và dạng sợi (C)……………………….16
Hình 1.5. Sơ đồ và hình ảnh chứng minh Mp1p là mannoprotein sinh độc lực quan trọng
của T.marneffei…………………………………………………………………………………………………18
Hình 1.6. Sơ đồ tìm hiểu về đặc tính sinh độc lực mannoprotein Mp1p của nấm
T.marneffei ………………………………………………………………………………………………………19
Hình 1.7. Tổn thương da trên bệnh nhân HIV nhiễm nấm T.marneffei lan tỏa …………23
Hình 1.8. Biểu hiện lâm sàng bệnh do nấm T.marneffei và IRIS tại BV.BNĐ [102]…24
Hình 1.9. Hình ảnh nấm T.marneffei ở môi trường nuôi cấy ………………………………….25
Hình 1.10. Phản ứng sandwich ELISA-Mp1p ……………………………………………………..29
Hình 1.11. Lượng giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên Mp1p………………….33
Hình 2.1. Minh họa phản ứng ELISA Mp1p sử dụng đĩa 96 giếng …………………………50
Hình 3.1. Bản đồ mật độ Mp1p huyết thanh > 0,2 OD theo nơi cư ngụ trên 100.000
người nhiễm HIV ……………………………………………………………………………………………..63
Hình 3.2. Thang điểm đánh giá nguy cơ nhiễm nấm Talaromyces marneffei khi không
thực hiện xét nghiệm ELISA Mp1p …………………………………………………………………….80
Hình 3.3. Thang điểm đánh giá nguy cơ nhiễm nấm Talaromyces marneffei khi thực
hiện xét nghiệm ELISA Mp1p ……………………………………………………………………………83xi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1.1. Số ca nhiễm T. marneffei trên bệnh nhân HIV/AIDS nhập viện tại Bệnh
viện Bệnh Nhiệt Đới từ năm 1996-2009………………………………………………………………10
Biểu đồ 3.1. Đặc điểm phân bố vi sinh sang thương da của mẫu nghiên cứu (n = 83) 59
Biểu đồ 3.2. Đặc điểm phân bố vi sinh trong máu của mẫu nghiên cứu (n = 126)…….60
Biểu đồ 3.3. Phân bố nồng độ Mp1p ở huyết thanh và nước tiểu ở nhóm bệnh nhân nhiễm
nấm Talaromyces marneffei (n = 70)…………………………………………………………………..63
Biểu đồ 3.4. Phân bố nồng độ Mp1p ở huyết thanh và nước tiểu giữa 2 nhóm bệnh Tm
(+) và NTCH khác…………………………………………………………………………………………….65
Biểu đồ 3.5. Phân bố nồng độ Mp1p ở huyết thanh và nước tiểu ở nhóm bệnh nhân Tm
(+) theo vị trí phân lập của Tm …………………………………………………………………………..66
Biểu đồ 3.6. Phân bố nồng độ Mp1p huyết thanh và nước tiểu theo độ nặng của Tm (n
= 70) ……………………………………………………………………………………………………………….67
Biểu đồ 3.7. Diện tích dưới đường cong của Mp1p huyết thanh chẩn đoán T.marneffei
(AUC = 0,93; KTC 95%: 0,88-0,98; p <0,001) ……………………………………………………72
Biểu đồ 3.8. Diện tích dưới đường cong của Mp1p nước tiểu trong chẩn đoán nhiễm
T.marneffei (AUC = 0,92; KTC 95%: 0,87-0,98; p <0,001) ………………………………….73
Biểu đồ 3.9. Xác suất phát triển thành nấm T.marneffei hoặc tử vong sau 6 tháng theo
dõi ở các trường hợp Mp1p ≥ 0,2 OD, cấy âm tính lúc nhập viện (n = 14) ………………7