Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần

ADN (Acid Deoxyribose Nucleic) là  một

đại phân tử được cấu thành từ các đơn phân là nucleotid. Trong cơ thể, tất cả các tế bào có nhân đều chứa phân tử ADN. Phân tử này mang toàn bộ thông tin di truyền của cá thể. Nguồn thông tin di truyền đó được ổn định nhờ hoạt động tự sao chép của ADN theo nguyên tắc “bán bảo tồn”. Đồng thời thông qua hoạt động của các bộ máy tế bào, nguồn thông tin này được chuyển sang các phân tử ARN thông tin ra ngoài bào tương tổng hợp nên phân tử protein:

ADN  sao mã  mARN      dịch mã   Protein

Trên cơ sở đó, sinh học phân tử đã phát triển các kỹ thuật di truyền trên ADN vào nghiên cứu và chẩn đoán một số bệnh. Để thực hiện kỹ thuật này đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu ADN đảm bảo cả về chất và lượng. Vì vậy, tách chiết ADN là khâu đầu tiên, cơ bản và rất quan trọng trong các qui trình thao tác trên ADN. Với tầm quan trọng đó, đề tài này tiến hành ứng dụng một số kỹ thuật tách ADN khác nhau và so sánh chúng với nhau.

Mục đích của đề tài là tìm ra một kỹ thuật phù hợp nhất với các tiêu chuẩn về: chất lượng ADN, hàm lượng ADN, thời gian tiến hành, chi phí thực hiện và mức độ độc hại đối với ng−ời thực hiện.

I. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

1. Đối tượng

Máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.

2. Phương pháp nghiên cứu

Thực hiện một số kỹ thuật tách ADN khác nhau với nguyên lý cơn bản gồm 4 bước:

• Phá vỡ hồng cầu

• Phá vỡ bạch cầu

• Loại bỏ protein

• Tủa ADN

Kỹ thuật tách ADN bằng Perchlorate sodium

(Kỹ thuật của S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F. Polesky – 1988)

• Hoá chất:

– Dung dịch I (cho 1 lít): Sucrose 0,3M 102g

Tris HCl 1M pH7.5 10mM   10ml

MgCl2   5mM 1g Triton 100 1% 10ml

– Dung dịch II (cho 500ml): NaCl 0,0075M 2,19g EDTA 0,024M 4,46g

– SDS (Sodium Dodecyle Sunfate) 10%

– Perchlorate sodium 5M

– NaCl 6M

– Cồn tuyệt đối

– Cồn 70%

– T.E (cho 1lít) gồm:

Tris HCl 1M pH8 10ml EDTA 0,5M pH8 2ml

• Qui trình tách:

➢ Phá vỡ hồng cầu:

– Lấy 10ml máu chống đông bằng EDTA.

– Thêm vào đó dung dịch I cho đủ 50ml.

– Trộn đều, ly tâm 4200 vòng/ 10 phút/ 40C.

– Loại bỏ n−ớc nổi, thu đ−ợc cặn trắng (nếu còn hồng cầu thì tiếp tục loại bỏ hồng cầu bằng dung dịch I).

➢ Phá vỡ bạch cầu:

– Sau khi thu được cặn trắng cho thêm vào: 4,5ml dung dịch II 125àl SDS 10%

1,1ml perchlorate sodium 5M 10àl Proteinase K 10mg/ ml

– Trộn đều, ủ 420C/ 30 phút, lắc nhẹ.

– Thêm 2ml NaCl 6M.

– Trồn đều, ly tâm 3500 vòng/ 15 phút/ 40C.

➢ Tủa ADN:

– Lấy nước nổi sang một tube khác.

– Thêm vào 2,5 thể tích cồn tuyệt đối,  lắc nhẹ, ủ ở -300C qua đêm thu được tủa  ADN dạng hình sứa.

– Rửa tủa bằng cồn 70%, để khô, hoà  tủa bằng T.E.

Kỹ  thuật  tách  ADN  bằng   acetate d’ammonium