Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex) trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy

Tiêu chảy là một bệnh khá phổ biến ở các nước trên thế giới, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Tỷ lệ mắc và tử vong do tiêu chảy rất cao ở trẻ em. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm có trên 1 tỷ lượt trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy với gần 5 triệu trẻ tử vong [5]. ë nước ta, tiêu chảy là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh d−ỡng, là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 ở trẻ em (chỉ xếp sau nhiễm khuẩn đường hô hấp).

Nhiều tác nhân vi sinh vật khác nhau có thể gây ra tiêu chảy, trong đó Escherichia coli thường chiếm tỷ lệ cao. Theo nghiên cứu của các tác giả trên thế giới tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em từ 21-60%, còn ở Việt Nam tỷ lệ này là 23,4 – 44,8% [1, 2, 3, 7, 9, 10].

Nhiều phương pháp chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy đã đ−ợc áp dụng. Ngay từ những năm 40, người ta đã sử dụng phương pháp định type huyết thanh. Sau này các phương pháp chẩn

đoán khác như ELISA, thử độc tính trên nuôi cấy tế bào, các tính chất sinh hoá, sự ly giải bởi phage đã được áp dụng. Song, chúng cũng đều là các phương pháp gián tiếp và đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp,  nên  ít  được ứng dụng  trong phân loại các E. coli gây tiêu chảy.

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều ph−ơng pháp chẩn đoán mới đã ra đời cho phép phát hiện được các gien đặc hiệu, quyết định khả năng gây bệnh của E. coli, trong đó 2 phương pháp, PCR và lai ADN, được áp dụng phổ biến nhất.

 Việt Nam, việc chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy, chỉ sử dụng phương pháp quai ruột và định type huyết thanh và cũng chỉ dừng lại ở ETEC (Enterotoxingenic E. coli) và EPEC (Enteropathogenic E. coli), EIEC (Enteroinvasive E. coli), EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli). PCR chẩn đoán

E. coli trên thế giới đã đ−ợc dùng phổ biến

nhưng các tác giả đều chỉ dùng đơn thuần một cặp mồi cho một phản ứng, do vậy tốn kém vật liệu và thời gian. Bởi vậy, việc nghiên cứu áp dụng một kỹ thuật phù hợp với nhiều cặp mồi, nhằm phát hiện nhiều loại E. coli gây tiêu chảy trong một phản ứng là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực. Trước tình hình đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu:

1. Tìm hiểu độ nhạy và độ đặc hiệu  của phản ứng PCR đa mồi trong xác định  E. coli gây tiêu chảy.

2. Tình hình phân bố các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ phân, máu, n−ớc tiểu, mủ và mật.

I. Đối tượng,  và phương pháp  nghiên cứu

1. Đối tượng

– Chủng  E.  coli  mẫu  gồm:  ETEC  ATCC 35401,  EHEC  ATCC  43890,   EHEC   ATCC 43889,  EPEC  ATCC   43887,   EIEC   ATCC 43893, EAEC     ATCC     130C2    do     Viện Karolinska Thụy Điển cung cấp.

– Chủng chuẩn của họ vi khuẩn đ−ờng ruột:

– Chủng  Shigella  flexneri,  Shigella   boydii, Shigella   dysenteriae,   Citrobacter    freundii, Salmonella typhi, Proteus  vulgaris,  Klebsiella pneumoniae,         Enterobacter        aerogenes, Edwardsiella  tarda,  Escherichia  coli  ATCC 25922 do Trung tâm l−u trữ nguồn gene vi sinh vật gây  bệnh, bộ môn Vi sinh vật tr−ờng Đại học Y Hà Nội cung cấp.

– Chủng E. coli từ bệnh phẩm: phân (150), n−ớc tiểu (40), máu (30), mật (40), mủ (40) đã

được xác định bằng các ph−ơng pháp thông th−ờng.

2. Vật liệu

– Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:  Sorbitol Mac Conkey, DCA.

– Môi trường dùng trong chẩn đoán  gồm: KIA,  ure-indol,  mannitol  –  di  động,   Citrat Simmons.

– Môi trường cấy vi khuẩn chuẩn bị cho tách chiết ADN: thạch th−ờng đĩa.

– Sinh phẩm, máy móc dùng trong PCR:

+ 8 cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 5 loại E.coli gây tiêu chảy: LT l-LT r, STI2 l-STI2 r, VT1 l-VT1 r, VT2 l-VT2 r, eae u-eae l, SHIG 1-SHIG 2, bfp2 u-bfP2 l, EA L-EA U.

+ Máy ly tâm lạnh (Beckman Avanti TM 30), máy điều nhiệt tự động Thermal Cycler (Eppendorf Đức), bộ điện di ngang (Advance Co.LTD, Nhật Bản), máy chụp ảnh gel và phim

ảnh Kodak cỡ 667.

3. Phương pháp

– Từ các chủng E.coli mẫu, các chủng thuộc họ vi khuẩn đường ruột đã kể ở trên  và các chủng vi khuẩn, bệnh phẩm được  tách chiết ADN  bằng  nhiệt  theo  quy   trình   của  Viện Krolinska Thụy Điển.

– Sau đó tiến hành chạy phản ứng PCR  đa mồi (8 cặp mồi) với chu kỳ như sau: 1 chu kỳ 96oC/4″;   30   chu   kỳ:   94oC/20″,   50oC/20″, 72oC/10″; 1 chu kỳ: 72oC/7″ giữ ở 4oC.

– Sản phẩm của phản ứng PCR đa mồi được tiến hành điện di trên thạch agarose 1,5%. Từ các chủng E.coli mẫu để xác định độ nhạy, các chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột để xác định độ đặc hiệu còn các chủng từ bệnh phẩm để xác định tình hình phân bố các chủng E. coli gây tiêu chảy.