Hiệu quả của PCR trong phát hiện M. tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm soi kính âm tính của bệnh nhân Lao

Chẩn đoán lao phổi và lao ngoài phổi âm tính  với  trực  khuẩn  kháng  cồn  kháng  toan (AFB) luôn là một thách thức khi mà kỹ thuật chẩn đoán  phòng thí nghiệm chủ yếu cho các trường hợp soi  kính âm tính vẫn là nuôi cấy cổ điển. Do thời gian chờ đợi kéo dài (4-8 tuần) trong khi độ nhậy cũng không cao đặc biệt đối với lao ngoài phổi [1, 2, 3], các nhà lâm sàng nhiều khi phải áp dụng phương pháp điều trị thử hoặc quyết định điều trị chỉ dựa trên triệu chứng  lâm  sàng.  Hệ  thống  đo  phóng  xạ BACTEC ra đời cho phép phát hiện sớm quá trình mọc của vi khuẩn nhờ cơ chất có đánh dấu phóng xạ giúp làm giảm thời gian chờ đợi xuống còn một nửa. Tuy vậy do chi phí mua sắm  cao  và  khó  khăn trong xử  lý  chất  thải phóng xạ, việc sử dụng vẫn còn hạn chế [4].

PCR là một kỹ thuật có thể thực hiện nhanh trong vòng 1-2 ngày, nh−ng lại có khả năng sao chép  trình  tự  đặc  hiệu  trên  genome  của  vi khuẩn từ một vài bản lên hàng trăm triệu đến hàng tỷ phiên bản. Trong khi soi kính chỉ xác định được vi khuẩn ở nồng độ tối thiểu 105/ 1 ml  bệnh  phẩm,  PCR  cho  phép  xác  định  vi khuẩn ở nồng độ rất thấp chỉ 1-3 vi khuẩn trong 1 bệnh phẩm [1]. PCR do vậy đ−ợc đánh giá là một công cụ có giá trị trong chẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn trong đó có bệnh lao. Tuy nhiên cho đến nay việc sử  dụng PCR trong chẩn đoán lao mới đ−ợc áp dụng hạn chế ở một số phòng thí nghiệm lớn ở Việt Nam. Hiệu quả và tính năng áp dụng của phương pháp còn chưa được nhiều nghiên cứu đề cấp đến một cách toàn diện, đặc biệt trong chẩn đoán lao AFB âm tính.

Mục tiêu của nghiên cứu là: Đánh giá hiệu quả kỹ thuật PCR trong phát hiện M. tuberculosis trực tiếp trong bệnh phẩm soi kính âm tính với trực khuẩn kháng cồn kháng axit của bệnh nhân lao

I. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1. Vật liệu:

Vật liệu bao gồm 254 bệnh phẩm của bệnh nhân lao và 60 bệnh phẩm của bệnh nhân nhóm chứng được điều trị tại viện Lao trung ương, bệnh viện Bạch Mai, viện Nhi trung ương, viện Quân Y 103 và trung tâm Chống lao Hà Nội. Bệnh phẩm của bệnh nhân lao bao gồm 100 mẫu đờm, 41 mẫu dịch rửa phế quản, 86 mẫu dịch não tuỷ và 27 mẫu dịch màng phổi. Tất cả các bệnh nhân này đều có kết quả AFB âm tính bằng soi kính hiển vi trực tiếp và sau này đều được chẩn đoán là bệnh nhân lao dựa vào kết luận cuối cùng kết hợp các kết quả thăm khám lâm sàng và các xét nghiệm khác. Bệnh phẩm nhóm chứng bao gồm 37 mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân viêm màng não có căn nguyên ngoài lao, 13 bệnh phẩm dịch màng phổi của bệnh nhân tràn dịch màng phổi do ung th− và 10 bệnh phẩm dịch rửa phế quản của bệnh nhân viêm phế quản không do lao

2. Phương pháp nghiên cứu:

Tất cả các bệnh phẩm trên được thu thập trong thời gian nghiên cứu (1997-2001) riêng lẻ cho từng trường hợp tại các bệnh viện mà bệnh nhân đến điều trị. Bệnh phẩm được gửi cùng ngày về phòng thí nghiệm Mycobacteria viện Vệ sinh dịch tễ trung ương không kèm theo thông tin về lâm sàng của bệnh nhân. Tất cả các bệnh phẩm đều được chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi Pt18 và INS2 đặc hiệu cho trình tự trên IS6110 của vi khuẩn lao nhóm điển hình. Trừ bệnh phẩm đờm, tất cả các bệnh phẩm đều được tiến hành nuôi cấy phân lập song song với PCR tại đây. Kết quả PCR được đối chiếu với kết luận cuối cùng của lâm sàng tại thời điểm bệnh nhân ra viện đồng thời so sánh với nuôi cấy. Các tính toán thống kê cũng được sử dụng để so sánh kết quả.

II. Kết quả

Tất cả các bệnh phẩm kể cả bệnh phẩm của bệnh nhân lao và bệnh nhân không lao nhóm chứng đều được xử lý tách chiết DNA, chạy PCR và điện di xác định kết quả trên gel agarose. Bệnh phẩm dương tính là bệnh phẩm cho vạch trên gel điện di đặc hiệu cho đoạn trình tự axit nucleic trên IS6110 được sao chép với cặp đoạn mồi sử dụng. Tỷ lệ dương tính với PCR đối với mỗi loại bệnh phẩm của các bệnh nhân mắc các thể lao khác nhau bao gồm lao màng não, lao tràn dịch màng phổi, lao phổi, và bệnh nhân nhóm chứng được trình bầy ở bảng 1.