Hoàn chỉnh hệ thống pcr đa mồi trong chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn thương hàn đa kháng thuốc

Các phương pháp thông thường chẩn đoán bệnh thương hàn đòi hỏi 4-6 ngày trong trường hợp dương tính và 7 ngày trong trường hợp xác định âm tính. Vì vậy, đã không đáp ứng được yêu cầu cấp bách của điều trị thương hàn. Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR bổ sung cho các kỹ thuật chẩn đoán kinh điển. Kỹ thuật này cho kết quả nhanh hơn và độ nhạy cũng cao hơn rất nhiều. Tuy vậy, các công trình này đều chỉ tập trung vào phát hiện S. typhi hoặc S. paratyphi A bằng các phản ứng riêng lẻ và không phát hiện được khả năng đa đề kháng của chúng. Điều đó gây tốn kém và không đáp ứng được nhu cầu của điều trị.

Việc tăng “phổ” phát hiện của PCR đối với các Salmonella khác (S. paratyphi B và S. para- typhi C chẳng hạn) và phát hiện sơ bộ khả năng đa đề kháng của chúng là cần thiết cho việc điều trị có hiệu quả cao hơn hiện nay. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Hoàn chỉnh hệ thống PCR  đa  mồi để chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn thương hàn đa kháng thuốc” nhằm 02 mục tiêu:

1. Phát triển hệ thống PCR mới, đa mồi để phát hiện các Salmonella gây bệnh thương hàn thường gặp ở nước ta.

2. Bước đầu đánh giá độ nhạy, đặc hiệu và phản ứng chéo của PCR nói trên trong  chẩn đoán bệnh thương hàn và theo dõi  sự hiện diện của vi khuẩn thương hàn đa kháng thuốc trong máu.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng

– Vi khuẩn: Salmonella typhi, S. paratyphi A,S. paratyphi B và S. paratyphi C.S. aureus, E. coli, B. cepacia, K. pneumoniae,P. aeruginosa, E. cloacae, P. mirabilis, Pseudomonas spp, P. multocida, C. freundii.

– Máu bệnh nhân thương hàn (đã được  xác định bằng cấy máu +): 36 mẫu.

– Máu bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết  (cấy máu +) do các vi khuẩn không phải Salmonella: 115 mẫu.

– Máu người lành: 60 mẫu.

2. Phương pháp

Định danh vi khuẩn
Các  vi  khuẩn dùng trong  nghiên  cứu  đều được định danh lại trên máy định danh tự động, Vitek-32 (BioMérieux, Inc., Mỹ) với các sinh phẩm (GNI và GPI Card) mua từ chính Hãng.

Chọn kháng nguyên đặc hiệu, thiết kế mồi và giải trình tự gen

Chọn kháng nguyên đặc hiệu: Mười kháng nguyên đặc hiệu cho từng loài Salmonella thông qua các yếu tố kháng nguyên O, H đặc hiệu và 

Chẩn đoán sớm bệnh thương hàn và phát hiện đa đề kháng của Salmonella có ý nghĩa lớn trong điều trị đặc hiệu kịp thời, hiệu quả cao. Mục tiêu: Phát triển PCR đa mồi và nghiên cứu các điều kiện tối ưu; Đối tượng và phương pháp: Giải trình tự gen kháng nguyên lông (H), thiết kế mồi, chạy PCR với các chủng Salmonella mẫu; thay đổi điều kiện phản ứng, chọn điều kiện tối ưu. Thử thách PCR đã được tối ưu với máu bệnh nhân thương hàn và không thương hàn. Kết quả: Điều kiện tối ưu cho PCR là: nhiệt độ gắn mồi 54,1oC – 59,5oC; nhiệt độ kéo dài mồi 71,4oC – 73,6oC; nồng độ MgCl2 1,5 – 2,5 mM. Sau 4 ngày điều trị đặc hiệu, không còn thấy vi khuẩn thương hàn trong máu bệnh nhân. Độ nhạy và đặc hiệu của PCR này là 100%, phản ứng chéo 0%. Kết luận: PCR đa mồi có khả năng chẩn đoán sớm bệnh thương hàn và phát hiện đa đề kháng của Salmonella với độ nhạy và đặc hiệu cao.