Hoàn chỉnh kỹ thuật chiết tách ADN từ máu trên giấy thấm và ứng dụng trong việc xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR

Các tác giả đã tiến hành kỹ thuật tách ADN từ máu trên giấy thấm, nhằm, mục đích sau: Hoàn chỉnh kỹ thuật tách ADN từ giọt máu trên giấy thấm thay cho 0,5 ml máu tĩnh mạch, chống đông bằng EDTA tr-ớc đây; Sử dụng ADN đã tách đê thực hiện PCR xác định giới tính và kiểm tra độ chính xác của kỹ thuật; B-ớc đầu áp dụng trên một số bệnh nhân nghiên cứu. Đối t-Ợng nghiên cứu là 30 học viên lớp kỹ thuật Y học gồm 10 nam, 20 nữ đã lập gia đình, có con, tuổi từ 25 đến 45 và 3 bệnh nhân mập mờ giới tính. Các tác giả đã sử dụng ph-ơng pháp một mù. Sau khi lấy 1 giọt máu từ đầu ngón tay lên giấy thấm có đ-ờng kính 0,5 – 1cm, thực hiện kỹ thuật chiết tách ADN. Với ADN này, các tác giả tiến hành phản ứng chuoi (PCR-polymerase chain reaction) với đôi mồi đặc hiệu TDF- A, TDF- B, giúp khuếch đại đoạn gen TDF nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thê Y. Vì thế, hình ảnh điện di sẽ xuất hiện sản phẩm gen TDF đối với nam và không cho sản phẩm với nữ. Kết quả của kỹ thuật tách ADN từ máu trên giấy thấm có độ đặc hiệu 100% cho nam.Vì vậy, kỹ thuật này hoàn toàn thay thế đ-Ợc cho kỹ thuật tách ADN từ 0,5 ml máu tĩnh mạch trong việc xác định giới tính cho các bệnh nhân ch-a rô giới tính.

Giới tính được hình thành qua 3 giai đoạn, giai đoạn trước và giai đoạn sau tác động qua lại lẫn nhau [1]: Hình thành giới tính gen học diễn ra khi thụ thai từ giao tử X của mẹ và X hoặc Y củabố tạo hỢp tử XX-nữ hay XY-nam.

•    Hình thành bộ phận sinh dục vào tuần thứ 6 đến tuần thứ 8 trên cơ sở NST giới đã đ-Ợc ấn định, giai đoạn này diễn ra d-ới sự kiểm soát và hoàn toàn phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt gen biệt hoá tinh determining region on Y), có chứa đoạn gen TDF (testis determining factor) nằm trên NST Y, nó khởi động hay hoạt hoá một loạt các gen khác. Kết quả là: ở các thai nam, với sự có mặt của NST Y bình th-ờng, d-ới sự tác động của yếu tố quyết định tinh hoàn TDF, tinh hoàn thai nhi hình thành.Nếu vắng mặt mặt NST Y v gen TDF, thai nhi sẽ hình thành buồng trứng.

•   Hình thành kiểu hình của giới . Đây là giai đoạn hình thành đặc tính sinh dục phụ thứ phát đặc tr-ng cho giới nhờ tác dụng của hor- mon testosteron hay estrogen, đ-Ợc sản xuất từ tinh hoàn hay buồng trứng.

Bất kỳ một sai sót nào xảy ra trong các giai đoạn trên sẽ khiến cho bệnh nhân có những bất th-ờng giới tính. Những bệnh nhân này chủ yếu có những dị dạng cơ quan sinh dục, rố’i loạn thể chất, thiểu năng sinh dục… trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Chính vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao có thể xác định giới tính sớm và chính xác cho trẻ mập mờ giới tính để có h-ớng điều trị phẫu thuật, liệu pháp hormon giúp trẻ có kiểu hình phù hỢp?

Xác định giới tính cho bệnh nhi mập mờ giới tính tại Việt Nam tr-ớc năm 1997, chủ yếu dựa trên định l-Ợng hormon sinh dục, xác định trẻ có cơ quan sinh dục là nam hay nữ hay cả hai qua thăm khám, siêu âm, chụp cản quang niệu đạo sinh dục. Và các kỹ thuật xác định NST giới qua tìm vật thể Barr, vật thể dùi trống, xác định bộ NST qua kỹ thuật nuôi cấy tế bào xác định karyotype. Các ph-ơng pháp trên chỉ dừng lại ở mức độ NST, không thể giải thích đ-Ợc nguyên nhân các tr-ờng hỢp kiểu hình nam có karyotype là 46, XX; kiểu hình nữ có karyotype là 46,XY. Chỉ có kỹ thuật phản ứng chuỗi PCR (polymerase chain reac­tion) mới phát hiện đ-Ợc các tr-ờng hỢp này [1].

Kỹ thuật PCR do Kaly Mullis phát minh năm 1985 [2], mở ra một triển vọng cho sự phát triển nhanh của sinh học phân tử. Nguyên lý của ph-ơng pháp này dựa trên đặc tính của ADN polymerase cho phép tổng hỢp một đoạn ADN bổ cứu với ADN khuôn nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid đánh dấu đoạn mở đầu và kết thúc [1]. Sau phản ứng đoạn ADN đích đ-Ợc nhân lên nhiều lần theo hàm số mũ. Sản phẩm của PCR đ-Ợc phát hiện sau điện di trên thạch agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọc d-ới ánh sáng đèn cực tím. PCR cho kết quả nhanh, chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Áp dụng những tiến bộ này, năm 1997, các tác giả Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An, Văn Đình Hoa và cộng sự đã sử dụng đôi mồi đặc hiệu AMEL-A, AMEL-B tìm gen Amelogenin thuộc đoạn gen SRY [3] và đôi mồi TDF-A, TDF-B khuếch đại gen TDF trên đoạn gen SRY [1] nhằm kiểm tra độ chính xác của các kỹ thuật PCR trong việc xác định giới tính. Hai nghiên cứu trên đều tách ADN từ 0,5 ml máu tĩnh mạch, chố’ng đông bằng EDTA đ-Ợc bảo quản lạnh và đều cho kết quả d-ơng tính 100% với nam và âm tính 100% với nữ.

Như vậy, từ năm 1997 đến nay, các tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR tìm gen TDF từ 0,5 ml máu tĩnh mạch chố’ng đông EDTA để xác định giới tính nam cho các bệnh nhân ch-a rõ giới tính. Nh-ng đố’i với các bệnh nhi nhỏ tuổi, gặp nhiều khó khăn trong việc lấy máu tĩnh mạch, còn các bệnh nhi ở xa thì khó khăn trong việc bảo quản vận chuyển mẫu. Do vậy, các tác giả tiến hành nghiên cứu và kiểm tra kỹ thuật chiết tách ADN từ máu trên giấy thấm nhằm thay thế cho kỹ thuật tách ADN từ máu tĩnh mạch tr-ớc đây với mục đích sau:

1.   Hoàn chỉnh kỹ thuật tách ADN từ giọt máu nhỏ trên giấy thâm.

2.   Sử dụng ADN đã tách để thục hiện PCR xác định giới tính và kiểm tra độ chính xác của kỹ thuật.