Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng
Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng.Đứt gãy DNA tinh trùng là một trong những rối loạn vật chất di truyền dẫn tới khả năng thụ tinh kém, thai kém phát triển hoặc thai dị tật bẩm sinh, dễ sảy thai. Theo ước tính, khoảng 25% bệnh nhân nam vô sinh có mức độ đứt gãy DNA tinh trùng cao [1]. Có rất nhiều mối liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng và kết quả tinh dịch đồ. Nam giới có kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ với tinh trùng có khả năng di động kém thường có tỷ lệ đứt gãy DNA cao. Tuy nhiên, có khoảng 10% bệnh nhân vô sinh nam có vấn đề về đứt gãy DNA tinh trùng lại cho kết quả tinh dịch đồ hoàn toàn bình thường [2].
Ngoài ra, ở những cặp vợ chồng vô sinh, đứt gãy DNA tinh trùng còn liên quan đến tiền sử sảy thai, thai lưu nếu đứt gãy xảy ra ở các vị trí gen liên quan đến làm tổ [3]. Chỉ số đứt gãy DNA tinh trùng cũng có giá trị rất cao trong việc tiên lượng khả năng sinh sản của nam giới, giúp lựa chọn phương pháp hỗ trợ sinh sản thích hợp và dự đoán tỷ lệ thành công của phương pháp hỗ trợ sinh sản đó [4].
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều phương pháp đánh giá mức độ đứt gãy DNA tinh trùng, phổ biến nhất là khảo sát mức độ phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện với chi phí thấp so với những phương pháp khác và hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện hiện nay [5]. Tuy nhiên, bộ kit xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng hiện nay phải nhập ngoại hoàn toàn, tại Việt Nam chưa có bộ kit riêng. Vì vậy, xét nghiệm này ở nước ta phụ thuộc nhiều vào nhà cung cấp cũng như nhà vận chuyển không chỉ về giá thành mà còn cả thời gian làm xét nghiệm. Để hạn chế nhược điểm này, góp phần đưa xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đến gần hơn với bệnh nhân, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng” với các mục tiêu sau:
1. Hoàn thiện quy trình pha chế bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng.
2. So sánh kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở nam giới bằng bộ xét nghiệm tự pha với bộ xét nghiệm thương mại Halosperm.
MỤC LỤC
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về đứt gãy DNA tinh trùng 3
1.2. Lịch sử nghiên cứu đứt gãy DNA tinh trùng 4
1.3. Nguyên nhân gây đứt gãy DNA tinh trùng 5
1.4. Cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng 5
1.5. Ảnh hưởng của đứt gãy DNA tinh trùng đến khả năng sinh sản ở nam giới 9
1.6. Các phương pháp xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng trên thế giới 13
1.7. Các tiêu chí đánh giá bộ xét nghiệm theo Tiêu chuẩn Việt Nam hiện nay 16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu 20
2.3. Các bước tiến hành xét nghiệm 22
2.4. Các bước tiến hành nghiên cứu 26
2.5. Phân tích và xử lý số liệu 30
2.6. Đạo đức nghiên cứu 30
Chương 3. KẾT QUẢ 31
3.1. Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng 31
3.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng bằng bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại 39
Chương 4. BÀN LUẬN 44
4.1. Hoàn thiện quy trình xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng 44
4.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng bằng bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại 51
Chương 5. KẾT LUẬN 57
5.1. Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng 57
5.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng và đánh giá tương đương kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng bằng bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại 57
KIẾN NGHỊ 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
Phụ lục 1. HỒ SƠ NGHIÊN CỨU 64
Phụ lục 2. BẢNG PHÂN PHỐI CHUẨN STUDENT 65
Phụ lục 3. ĐỘ LẶP LẠI TỐI ĐA CHẤP NHẬN (THEO AOAC) 66
Phụ lục 4. DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lewis S. E, John Aitken R., Conner S. J. et al (2013). The impact of sperm DNA damage in assisted conception and beyond: recent advances in diagnosis and treatment. Reprod Biomed Online, 27 (4), 325-337.
2. Mã Phạm Quế Mai, Nguyễn Thị Thúy An và Nguyễn Trương Thái Hà (2014). Khảo sát mối tương quan giữa các chỉ số tinh dịch đồ và chỉ số phân mảnh DNA tế bào tinh trùng người bằng phương pháp Neutral Comet, Hội nghị vô sinh nam và nam học lần III, 2014,
3. Carlini T., Paoli D., Pelloni M. et al (2017). Sperm DNA fragmentation in Italian couples with recurrent pregnancy loss. Reprod Biomed Online, 34 (1), 58-65.
4. Osman A., Alsomait H., Seshadri S. et al (2015). The effect of sperm DNA fragmentation on live birth rate after IVF or ICSI: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online, 30 (2), 120-127.
5. Rex A.S., Fedder J. (2017). DNA fragmentation in spermatozoa: a historical review. Andrology, 5(4), 622-630.
6. Ward W.S., Barratt C.và Mortimer D. (1997). Chromosome organisation in mammalian sperm nucleic. Genetics of Human Male Infertility, 205-221.
7. Denny S., Mariethoz E., Giancarlo M. et al (1999). Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa. Reviews of Reproduction, 4, 31 – 37.
8. Aitken R.J. và De Iuliis G.N (2010). On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa. Molecular Human Reproduction, 16 (1), 3 – 13.
9. Pollister M. A. (1946). The nucleoprotamine of trout sperm. J Gen Physiol, 30, 101-116.
10. Leuchtenberger S.F.C, Weir D.R. (1953). The desoxyribosenucleic acid (DNA) content in spermatozoa of fertile and infertile human males. Chromosoma, 6, 61-78.
11. Ringertz G. B., Darzynkiewicz Z. (1970). Changes in deoxyribonucleoprotein during spermiogenesis in the bull. Sensitivity of DNA to heat denaturation. Exp Cell Res, 62, 204-218.
12. Evenson D.P., Melamed M.R. (1980). Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science, 210, 1131-1133.
13. Robert J.A. et al (2017). DNA damage in human spermatozoa; important contributor to mutagenesis in the offspring. Transl Androl Urol, 4 (6), S761-S764.
14. Sakkas D., Alvarez J.G. (2010). Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis. American Society for Reproductive Medicine, 93 (4), 1027 – 1036.
15. Monica M. et al (2015). Investigation on the Origin of Sperm DNA Fragmentation: Role of Apoptosis, Immaturity and Oxidative Stress. Molecular Medicine, 21, 109 – 122.
16.. Bejarano I, Rodriguez A. B., Pariente J. A. (2018). Apoptosis Is a Demanding Selective Tool During the Development of Fetal Male Germ Cells. Front Cell Dev Biol, 6, 65.
17. Garcia-Peiro A., Martinez-Heredia J., Oliver-Bonet M. et al (2011). Protamine 1 to protamine 2 ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm. Fertil Steril, 95 (1), 105-109.
18. Marcon L. và Boissonneault G. (2004). Transient DNA strand breaks during mouse and human spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling. Biol Reprod, 70 (4), 910-918.
19. Sakkas D., Manicardi G., Bianchi P. G. et al (1995). Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa. Biol Reprod, 52 (5), 1149-1155.
20. Geoffry N.D. et al (2009). DNA Damage in Human Spermatozoa Is Highly Correlated with the Efficiency of Chromatin Remodeling and the Formation of 8-Hydroxy-2 -Deoxyguanosine, a Marker of Oxidative Stress. BIOLOGY OF REPRODUCTION, 81, 517 – 524.
21. Billig H., Furuta I., Rivier C. et al (1995). Apoptosis in testis germ cells: developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages. Endocrinology, 136 (1), 5-12.
22. Xie D., Lu C., Zhu Y. et al (2018). Analysis on the association between sperm DNA fragmentation index and conventional semen parameters, blood microelements and seminal plasma ROS in male patients with infertility. Exp Ther Med, 15 (6), 5173-5176.
23.. Aitken R. J, Baker M. A., Sawyer D.(2003). Oxidative stress in the male germ line and its role in the aetiology of male infertility and genetic disease. Reprod Biomed Online, 7 (1), 65-70.
24. O’Flaherty C., Vaisheva F., Hales B.F. (2008). Characterization of sperm chromatin quality in testicular cancer and Hodgkin’s lymphoma patients prior to chemotherapy. Hum Reprod, 23 (52), 1044.
25. Martenies S. E, Perry M. J. (2013). Environmental and occupational pesticide exposure and human sperm parameters: a systematic review. Toxicology, 307, 66-73.
26. Erenpreiss J., Spano M., Erenpreisa J. et al (2006). Sperm chromatin structure and male fertility: biological and clinical aspects. Asian J Androl, 8 (1), 11-29.
27. Nguyễn Hữu Sơn (2017). Đặc điểm đứt gãy DNA tinh tùng ở nam giới thất bại trong hỗ trợ sinh sản, Luận án tốt nghiệp bác sỹ đa khoa, Trường Đại học Y Hà Nội
28. Nguyễn Viết Tiến, Ngô Huy Toàn và Bạch Huy Anh (2009). Nghiên cứu thực trạng vô sinh ở Việt Nam theo các vùng sinh thái, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Đại học Y Hà Nội,
29. Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh và Lê Văn Vệ (2009). Vô sinh nam giới, Bệnh học giới tính nam, Nhà xuất bản Y học, 72-122.
30. Utsuno H., Oka K., Yamamoto A. et al (2013). Evaluation of sperm head shape at high magnification revealed correlation of sperm DNA fragmentation with aberrant head ellipticity and angularity. Fertil Steril, 99 (6), 1573-1580.
31. Cassuto N. G., Hazout A., Hammoud I. et al (2012). Correlation between DNA defect and sperm-head morphology. Reprod Biomed Online, 24 (2), 211-218.
32. Irvine D. S., Twigg J. P., Gordon E. L. et al (2000). DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality. J Androl, 21 (1), 33-44.
33. Sheikh N., Amiri I., Farimani M. et al (2008). Correlation between sperm parameters and sperm DNA fragmentation in fertile and infertile men. International Journal of Reproductive BioMedicine, 6 (1), 13 – 18.
34. Avendano C., Franchi A., Taylor S. et al (2009). Fragmentation of DNA in morphologically normal human spermatozoa. Fertil Steril, 91 (4), 1077-1084.
35. Virro M.R., Larson-Cook K.L., Evenson D.P. (2004). Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril, 81 (1289-95),
36. Zini A., Dohle G. (2011). Are varicoceles associated with increased deoxyribonucleic acid fragmentation? Fertil Steril, 96 (6), 1283-1287.
37. Blumer C. G., Fariello R. M., Restelli A. E. et al (2008). Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele. Fertil Steril, 90 (5), 1716-1722.
38. Bertolla R. P., Cedenho A. P., Hassun Filho P. A. et al (2006). Sperm nuclear DNA fragmentation in adolescents with varicocele. Fertil Steril, 85 (3), 625-628.
39. Phạm Thị Xuân (2016). Đánh giá sự đứt gãy ADN của tinh trùng nam giới trong các cặp vợ chồng sảy thai, thai lưu, Luận văn tốt ngiệp bác sỹ đa khoa, Đại học Y Hà Nội,
40. Robinson L., Gallos I. D., Conner S. J. et al (2012). The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod, 27 (10), 2908-2917.
41. Hamidi J., Frainais C., Amar E. et al (2015). A double-blinded comparison of in situ TUNEL and aniline blue versus flow cytometry acridine orange for the determination of sperm DNA fragmentation and nucleus decondensation state index. Zygote, 23 (4), 556-562.
42. Evenson D. P. (2016). The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA((R))) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci, 169, 56-75.
43. Sharma R., Masaki J., Agarwal A. (2013). Sperm DNA fragmentation analysis using the TUNEL assay. Methods Mol Biol, 927, 121-136.
44. Chenlo P. H., Curi S. M., Pugliese M. N. et al (2014). Fragmentation of sperm DNA using the TUNEL method. Actas Urol Esp, 38 (9), 608-612.
45. Ribas-Maynou J., Fernandez-Encinas A., Garcia-Peiro A. et al (2014). Human semen cryopreservation: a sperm DNA fragmentation study with alkaline and neutral Comet assay. Andrology, 2 (1), 83-87.
46. Ribas-Maynou J., Garcia-Peiro A., Fernandez-Encinas A et al (2013). Comprehensive analysis of sperm DNA fragmentation by five different assays: TUNEL assay, SCSA, SCD test and alkaline and neutral Comet assay. Andrology, 1 (5), 715-722.
47. Fernandez J. L., Muriel L., Rivero M. T. et al (2003). The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. J Androl, 24 (1), 59-66.
48. Fernandez J. L., Muriel L., Goyanes V. et al (2005). Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test. Fertil Steril, 84 (4), 833-842.
49. Nguyễn Thị Thúy An (2014). Kết quả so sánh chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng bằng kit Halosperm và quy trình SCD xây dựng tại Trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản, Khoa Y, Đại học Quốc gia TPHCM, Hội nghị IVF EXPERTS MEETING 10, Vũng Tàu.
50. Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
51. Lwanga S.K. và Lemeshow S. (1991). Sample size determination in Health studies, a practical manual., WHO, Geneva,
52. Duran E. H., Morshedi M., Taylor S. et al (2002). Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study. Hum Reprod, 17 (12), 3122-3128.
53. Fernandez et al (2003). Based on Sperm Chromatin Dispersion Test (SCDT) for humans, the sperm DNA integrity in bulls has been assessed by Sperm Bos Halomax (SBH) assay. J Androl, 24 (1), 59 – 66.
54. Phạm Tuấn Hưng (2018). Cải tiến quy trình xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở nam giới vô sinh, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ y khoa, Đại học Y Hà Nội,
55. Martin B. J. và Altman D. STATISTICAL METHODS FOR ASSESSING AGREEMENT BETWEEN TWO METHODS OF CLINICAL MEASUREMENT. The Lancet, 327 (8476), 307 – 310.
56. Bộ Khoa học và Công nghệ (2017). Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 3591:2017 Aga.
57. Triệu Tiến Sang (2018). Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 7B, 17-22.
58. Sadeghi S., Celma F., Valverde A., Fereidounfar S., (2016). Morphometric comparison by the ISAS® CASA-DNAf system of two techniques for the evaluation of DNA fragmentation in human spermatozoa. Asian J Androl, 18(6), 835-839.
59. Wiweko B. (2017). Predictive value of sperm deoxyribonucleic acid (DNA) fragmentation index in male infertility. Basic and clinical andrology, 27, 1-7.