HOÀN THIỆN YẾU TO KỸ THUẬT CỦA XÉT NGHIỆM TÌM ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN VÙNG AZFa, AZFb VÀ AZFc NHIEM SẮC THỂ Y
TÓM TẮT
Mở đâu : Đột biên mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y đã được xác định có liên quan đến tình trạng rối loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng thành tinh trùng.
Mục tiêu : Hoàn thiện kỹ thuật xét nghiệm phát hiện loại đột biên này.
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu : Thử nghiệm một số yêu tố kỹ thuật của xét nghiệm : chọn loại enzyme Taq polymerase phù hợp, xác định độ nhạy của multiplex PCR mix.
Kết quả : HotStart Taq DNA Polymerase của Qiagen® là enzyme tối ưu cho kỹ thuật nhưng Thermo Taq Polymerase của ABgene® vẫn cho kết quả vẫn chấp nhận được. Độ nhạy của MPCR mix được xác định là 5ng DNA/pl trong khi nồng độ DNA tốt nhất cho phản ứng là 20ng/pl.
Kết luận : Đã xác định thành công một số đỉêu kiện kỹ thuật của xét nghiệm, hy vọng kết quả trên sẽ giúp ích cho các nghiên cứu tiếp theo khảo sát loại đột biên này
ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Trước đây vô sinh thường được cho là do người vợ. Tuy nhiên khi các khảo sát trên nam giới được đẩy mạnh thì có 35-40% nguyên nhân vô sinh là do người chồng, trong đó khoảng 90% có liên quan đến các bất thường sinh tinh (2). Các đột biến mất đoạn vùng AZF của nhiễm sắc thể Y, được tác giả Tiepolo và Zuffardi báo cáo lần đầu tiên năm 1976, có liên quan đến sự rối loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng thành tinh trùng do đó làm giảm mạnh khả năng có con (4). Đứng trước nhu cầu cần có một công cụ khảo sát loại rối loạn di truyền này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm hoàn thiện các yếu tố kỹ thuật của xét nghiệm tìm đột biến vùng AZFa, b và c trên nhiễm sắc thể Y.
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
Lấy 3mL máu ngoại biên chống đông bằng EDTA. Ly trích DNA bộ gen từ tế” bào bạch cầu với tỷ số tinh khiết từ 1,8 – 2,0.
Mỗi mẫu DNA được chạy 2 phản ứng Multiplex PCR cùng lúc, mỗi phản ứng khuếch đại 5 đoạn DNA (gồm 2 đoạn gen ZFY, SRY là chứng nội tại và 3 đoạn gen thuộc 3 vùng AZFa, b, c). Các cặp mồi sử dụng phát hiện được 95% trường hợp mất đoạn trên vùng AZF (3). Chứng nam, chứng nữ (DNA của một người nam và người nữ bình thường) và chứng nước được chạy song song với mỗi mẫu DNA bệnh nhân. Lần lượt thay đổi các loại Taq DNA polymerase (HotStart Taq polymerase của Qiagen®, Thermo Taq củaABgene®, Taq polymerasecủa
Promega®) với lượng không đổi là 2u/50 pl phản ứng để xác định được loại enzyme tối ưu cho phản ứng. Nồng độ trong một phản ứng của Mg2+ là 6.5mM, của mồi là 2pmol mỗi loại và của dNTPs là 0,3mM. Chu kỳ nhiệt phản ứng là 950C 6′ , 940C 30” , 550C 30″, 720C 60” , 35 chu kỳ, 720C 10′. Sản phẩm PCR được chạy điện di ở 100V trong 40 phút trên gel agarose 2,5%, với chất phát quang ethidium
Hy vọng sẽ giúp ích cho các bạn, cũng như mở ra con đường nghiên cứu, tiếp cận được luồng thông tin hữu ích và chính xác nhất