Kết quả kiểm tra đánh giá chất lượng huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia chế tạo tại Việt Nam

Cho đến nay, rắn độc cắn vẫn là một bệnh lý rất cần được quan tâm. Tại hội nghị Chống độc Châu Á-Thái Bình Dương (APAM) 2010, chủ tịch Hội Độc học Quốc tế (IST) thông báo: “Mỗi năm, cả thế giới có tới 5 triệu người bị rắn độc cắn, làm chết 125 ngàn người” [4]. Riêng Việt Nam, mỗi năm có khoảng 30 000 người bị rắn cắn, 2/3 trong số đó bị nhiễm độc, đặc biệt nguy hiểm là rắn cạp nia (RCN), loài rắn có độc tính cực mạnh, gây tử vong cao > 20% [5].

Để điều trị bệnh nhân bị rắn độc cắn hiệu quả, đòi hỏi phải có huyết thanh kháng nọc (HTKN) đặc hiệu với chất lượng tốt. Tại Hội nghị chuyên đề ở Jakakta 2008, một lần nữa Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) lại khẳng định: Tử vong hoặc thương tật do nhiễm độc nọc rắn có thể tránh được, nếu cung cấp đủ và kịp thời HTKN đã được kiểm tra, đảm bảo chất lượng tốt [6].

Nhằm thiết thực phục vụ cứu chữa người bệnh bị RCN cắn tại Việt Nam, chúng tôi đã nghiên cứu sản xuất thành công HTKN rắn cạp nia. Tuy nhiên, khâu quyết định cuối cùng trước khi hoàn thành sinh phẩm là “Kiểm tra chất  lượng”. Vì vậy, đề tài: “Đánh giá chất lượng  sản  phẩm  HTKN  rắn  cạp  nia  trong phòng thí nghiệm” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:

Xây dựng các kỹ thuật chủ yếu kiểm tra chất lượng HTKN RCN theo Tiêu chuẩn Quốc gia và khuyến cáo của WHO.

Đánh  giá  tính  an  toàn  và  hiệu  lực  của HTKN rắn cạp nia.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

– Huyết thanh kháng nọc RCN, sản  phẩm nghiên cứu của Thái Danh Tuyên và CS, sản xuất tại Trung tâm chống độc Quốc gia, bệnh viện Bạch Mai; lấy ngẫu nhiên 30 mẫu.

– Nọc rắn cạp nia do Viện nghiên cứu kỹ

thuật phát triển nông thôn cung cấp.

– Chuột nhắt trắng (18-20g/con) x 100 con.

– Chuột lang 250- 300 g/con x 3 con.

– Thỏ 2,5- 3,0 kg/con x 3 con

– Trang thiết bị chuyên dùng tinh chế  và kiểm tra chất lượng HTKN.

– Hóa chất: môi trường nuôi cấy vi khuẩn Saboraud và Thioglycolate,…

2. Phương pháp

Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu labo kết hợp với + thực nghiệm trên động vật.

Nội dung nghiên cứu

– Kiểm định chất lượng tại cơ sở sản xuất các chỉ tiêu: an toàn chung, chất gây  sốt, vô khuẩn, hiệu lực theo đơn vị (LD50 và ED50).

– Kiểm định chất lượng tại Viện Kiểm định

Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế (VKĐQGVX&SPYT).

– So sánh, đối chiếu với tiêu chuẩn  quốc gia về các sản phẩm huyết thanh sử dụng trên người tại Dược điển Việt Nam IV, 2009 [1].

– Ứng dụng điều trị bằng HTKN RCN  với bệnh nhân nhiễm độc nọc RCN rất nặng, đe dọa tử vong.

Phương pháp tiến hành

*  Kiểm định cơ sở: theo hướng dẫn của WHO – 2008 và Dược điển Việt Nam IV (2009) [1,6].

+  Tính  LD50:  Cân  nọc  RCN  và  hòa  tan

bằng NaCl  0,9% để có dung dịch nồng độ 1000 mg/ml (bảo quản trong tủ lạnh). Từ dung dịch nọc rắn gốc này pha loãng tiếp để có dung dịch có nồng độ 500mg/ml (dung dịch nọc rắn thử nghiệm). Từ dung dịch nọc này, tiến hành pha loãng cách nhau 1,5 lần thành 5 độ pha loãng liên tiếp, sao cho sau khi tiêm độ pha loãng thấp nhất chuột phải chết 100% và độ pha loãng cao nhất chuột phải sống 100% (sau khi pha xong lắc đều và để ở 37OC/30 phút, tránh ánh sáng). Chuột nhắt trắng thí nghiệm tiêu chuẩn của viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp, cho ăn đầy đủ, nuôi nhốt 5 ngày trước khi thí nghiệm. Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột với liều 0,2ml/con. Mỗi độ pha tiêm 8 chuột. Trong 24 giờ, theo dõi số chuột sống, chết trong mỗi độ pha loãng. Tính LD50 theo công thức Karber [3]: LD50 = LD100 – (Z d/n).

Trong đó: Z là số trung bình tử vong của 2 nhóm kế cận, d: khoảng cách liều lượng giữa các nhóm, n: số động vật thử nghiệm trong từng nhóm.

 

+ Tính ED50: Pha HTKN rắn cạp nia tăng dần từ 60 µl/ml đến 80 µl/ml. Nọc rắn cạp nia pha trong dung dịch PBS: 40LD50 /ml; trộn đều với từng độ pha loãng HTKN, với cùng thể tích. Ủ hỗn dịch trên ở 37oC/1h. Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột dung dịch nọc + HTKN, liều lượng: 0,2ml/chuột. Số chuột thí nghiệm mỗi lô: 8 con.Theo dõi trong 24 giờ, ghi nhận số chuột chết, sống, tính tỷ lệ (%), tính ED50.

+ Tìm chất gây sốt: chọn 3 thỏ khỏe, nặng 2,5 – 3,0kg, nuôi trong khu động vật thí nghiệm 1 tuần.

Ngày thí nghiệm: tiêm HTKN RCN vào tĩnh mạch tai thỏ với thể tích V = 1ml/kg x trọng lượng. Đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước và sau khi tiêm HTKN, thời gian cách nhau 1 giờ. Qui định: chênh lệnh nhiệt độ cao nhất và thấp nhất < 1oC. Nếu nhiệt độ tăng trên > 1oC: do chất gây sốt tạo ra.

+ Vô trùng: cấy HTKN phát hiện vi khuẩn và nấm  tại  Labo Vi  sinh y học,  bệnh viện Bạch Mai.

+ An toàn chung: chọn 3 chuột lang khỏe,

trọng lượng từ 300-350g, nuôi trong điều kiện khu động vật thí nghiệm 1 tuần trước khi thí nghiệm.  Ngày thí  nghiệm: tiêm  HTKN RCN vào phúc mạc chuột, V = 1ml/100g x trọng lượng chuột. Theo dõi chuột trong 3 tuần về trọng lượng, hiện tượng rụng lông. Nếu chuột vẫn phát triển bình thường, tăng cân: là HTKN RCN an toàn trên động vật thí nghiệm.

* Điều trị thử một số bệnh nhân bị RCN cắn, nhiễm độc nặng, đe dọa tử vong. Điều kiện: lãnh đạo Trung tâm chống độc Quốc gia (TTCĐQG) cho phép điều trị bằng HTKN RCN của đề tài nghiên cứu; gia đình bệnh  nhân tình nguyện điều trị, cam kết văn bản lưu trong bệnh án.

* Tổng hợp kết quả kiểm định cơ sở, kiểm định quốc gia, Kết quả điều trị trên người tình nguyện để đánh giá tính an toàn và hiệu lực của HTKN RCN.