Một số đột biến vùng gen S virus viêm gan B

Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề mang tính toàn cầu và được xem là nguyên nhân chính của các bệnh lý như viêm gan, xơ gan và ung thư gan. Việc chẩn đoán, sàng lọc HBV hiện nay trên thế giới chủ yếu dựa vào việc phát hiện kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của virus – kháng nguyên được mã hoá trong vùng gen S.

Genome của virus viêm gan B có tốc độ đột biến nhanh, ước tính 2.104   thay thế điểm/ năm, cao hơn so với các virus ADN khác [4]. Các đột biến có thể xảy ra ở tất cả các vùng thuộc ge- nome, đặc biệt các đột biến thuộc vùng gen S, gen mã hoá cho HBsAg, thường dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng do gây ra những thay đổi về đặc tính miễn dịch của HBsAg khiến cơ thể không thể nhận diện được các virus mang đột biến. Điều này có thể làm mất hiệu lực của các loại vắcxin viêm gan B hiện nay, tăng nguy cơ mắc bệnh viêm gan B, tăng nguy cơ lây truyền HBV qua truyền máu do không loại bỏ được các đơn vị máu bị nhiễm HBV bằng các bộ kít sàng lọc HBsAg hiện đang sử dụng. Mục tiêu:

Tìm hiểu một số đột biến trong vùng gen S của virus viêm gan B hay gặp ở Việt Nam, từ đó cung cấp một số thông tin ban đầu cho việc cải tiến các kít chẩn đoán, sàng lọc HBV và các loại văcxin viêm gan B tái tổ hợp.

II. ĐỐI   TƯỢNG   VÀ   PHƯƠNG   PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

75 bệnh nhân được chỉ định theo dõi viêm gan B tại Labo trung tâm Y sinh, Đại học Y Hà Nội trong khoảng thời gian 2004 – 2005. Độ tuổi trung bình: 18 – 43.

2. Phương pháp nghiên cứu

Xét nghiệm huyết thanh học:

Bước sàng lọc

Các xét nghiệm chẩn đoán huyết thanh học HBsAg theo nguyên lý miễn dịch gắn men (ELISA) được thực hiện trên 2 loại kit (BioRad, Mỹ): Mono- lisa HBsAg Plus phát hiện HBsAg dạng bình thường và Monolisa HBsAg Ultra phát hiện đồng thời cả HBsAg bình thường và đột biến.

Tách  ADN  và  khuếch  đại  HBV-   ADN bằng PCR ADN của HBV được tách chiết từ 100µl huyết không hiện băng khi điện di, có thể mẫu này không có AND do quá trình thực hiện kỹ thuật hoặc do mẫu khi lưu trữ không bảo đảm, vì vậy chúng tôi không thực hiện được giải trình tự nucleotide của mẫu này.

Bảng 1. Tỷ số S/CO ở 8 mẫu chọn để tiến hành phản ứng PCR

Stt

 Mẫu S/CO (Plus) S/CO (Ultra) thanh  bằng  kít  QIAGEN  SpinColumns-  sau  đó          

ADN được nhân lên bằng kỹ thuật PCR – kit Mas- termix (Promega, Mỹ). Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại vùng gen S (chứa vùng quyết định kháng nguyên “a”):

5’-CAAGGTATGTTGCCCGTTTG-3’ (mồi xuôi, vị trí 301 – 320) và

5’-AAAGCCCTGCGAACCACTGA-3’  (mồi  ngược, vị trí 540 – 559) được thiết kế theo nghiên cứu của Kobayashi  và  Koike  [3]. Tổng thể tích cho  một phản ứng PCR là 25ml, sản phẩm được tiến hành điện di trên gel agarose1,5%.

Để thu nhận ADN khuôn dùng trong giải trình tự, chúng tôi cũng tiến hành phản ứng PCR với thành phần và chu kỳ nhiệt giống như trên, tuy nhiên tổng thể tích cho 1 phản ứng là 50µl và sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%.

Giải trình tự vùng gen S  dài 219bp: phát hiện đột biến

Chúng tôi sử dụng bộ kít sinh phẩm và máy của hãng Applied Biosystem (Mỹ). Phản ứng giải trình tự nucleotide dựa trên phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy sử   dụng Big Dye terminator. Kết quả được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng: Sequencing Analysis, DNA Star.