Một số gen mã hoá cacbapenemase và mối liên quan với mức độ kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii tại Việt Nam

Luận án tiến sĩ y họcMột số gen mã hoá cacbapenemase và mối liên quan với mức độ kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii tại Việt Nam.Những năm gần đây, Acinetobacter baumannii từ một vi khuẩn gây bệnh cơ hội đã trở thành một mầm bệnh “báo động đỏ” đe dọa đến sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới với khả năng gây ra các bệnh nhiễm khuẩn nặng, mức độ kháng thuốc và tỷ lệ tử vong cao [1],[2]. A. baumannii là một trong những tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV). Đặc biệt, A. baumannii thường đứng thứ nhất hoặc thứ 2 trong số căn nguyên gây viêm phổi liên quan đến thở máy (Ventilator-associated pneumonia-VAP) [3]. Ngoài các yếu tố độc lực, khả năng đề kháng kháng sinh (KS) đã giúp A. baumannii trở thành một trong những căn nguyên gây nhiễm khuẩn khó điều trị nhất hiện nay. A. baumannii có thể đề kháng với tất cả các KS hiện có được sử dụng trên lâm sàng.

Đặc biệt, A. baumannii kháng carbapenem (Carbapenem resistant A. baumannii – CRAB) đã gia tăng nhanh chóng trên toàn thế giới ở mức độ báo động. CRAB được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm vi khuẩn ưu tiên số 1 hiện nay trong việc kiểm soát và điều trị [4]. Vi khuẩn có rất nhiều cơ chế đề kháng carbapenem khác nhau [5]. Tuy nhiên, sinh carbapenemase vẫn là cơ chế đề kháng carbapenem chủ yếu và quan trọng nhất ở A. baumannii [6],[7]. Nhiều loại carbapenemase ở A. baumannii đã xuất hiện và ngày càng đa dạng hơn với rất nhiều biến thể mới. [6]. Tuy nhiên, carbapenemase lớp D và B mà đặc biệt là lớp D là loại phổ biến nhất ở A. baumannii trên toàn thế giới nói chung và ở Châu Á nói riêng [8],[9],[10].
Nhiều gen mã hóa carbapenemase ở A. baumannii nằm trên nhiễm sắc thể và/hoặc plasmid, chúng thường được kết hợp trong hoặc cùng với các yếu tố di truyền di động (mobile genetic elements), nên dễ dàng được lan truyền ngang (Horizotal transfer) sang các vi khuẩn cùng loài và khác loài [6],[11].
Việc xác định sớm các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase để thực hiện các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn và lựa chọn KS thích hợp là rất quan trọng [12]. Tuy nhiên, do tính thấm nội tại của màng ngoài ở Acinetobacter thấp2 [13] và hoạt tính enzyme của một số loại carbapenemase ở Acinetobacter yếu, nên phát hiện carbapenemase ở Acinetobacter được cho là khó hơn so với Enterobacteriaceae và Pseudomonas spp [14],[15].
Hiện nay ở Việt Nam, A. baumannii không những là một trong ba căn nguyên chính gây NKBV với mức độ đề kháng carbapenem rất cao [16],[17],[18]. Đã có những nghiên cứu về một số gen đề kháng carbapenem ở A. baumannii qua cơ chế sinh carbapenemase [19],[20],[21],[22],[23]. Tuy nhiên, các đề tài này thường chỉ nghiên cứu trên các chủng A. baumannii phân lập ở một hoặc một số bệnh viện tại một vùng miền/khu vực. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hà thực hiện trên các chủng A. baumannii gây nhiễm
khuẩn huyết từ 7 bệnh viện ở 3 miền của Việt Nam (2011-2012) và mới chỉ
nghiên cứu một số gen blaOXA [19]. Hơn nữa, hiện chưa có nghiên cứu nào về phương pháp phát hiện sinh carbapenemsae trên các chủng A. baumannii lưu hành ở Việt Nam để xác nhận phương pháp phù hợp cho thực hành thường qui tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Việc phát hiện sớm, chính xác các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase để thực hiện các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn và lựa chọn KS thích hợp là rất quan trọng. Vì lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài “Một số gen mã hoá cacbapenemase và mối liên quan với mức độ kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii tại Việt Nam”, với 3 mục tiêu:
1. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của carbapenem với các chủng A. baumannii phân lập tại Việt Nam năm 2016.
2. Phát hiện một số gen mã hoá carbapenemase lớp D và B của các chủng A. baumannii.
3. Tìm mối liên quan giữa MIC với sự xuất hiện carbapenemase và gen mã hóa carbapenemase

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………………….. 1
Chương 1. TỔNG QUAN………………………………………………………………….. 3
1.1. KHÁNG SINH NHÓM CARBAPENEM………………………………………… 3
1.1.1. Cấu trúc của kháng sinh nhóm carbapenem ……………………………… 3
1.1.2. Cơ chế tác động của carbapenem……………………………………………. 4
1.2. ACINETOBACTER BAUMANNII ……………………………………………….. 5
1.2.1. Đặc điểm sinh học của A. baumannii………………………………………. 5
1.2.2. Các yếu tố độc lực của A. baumannii………………………………………. 6
1.2.3. Khả năng gây bệnh của A. baumannii……………………………………… 9
1.2.4. Đặc điểm bộ gen liên quan đến độc lực, khả năng gây bệnh và
sức đề kháng của A. baumannii ……………………………………………… 11
1.2.5. Tình hình kháng kháng sinh của A. baumannii ……………………….. 12
1.2.6. Cơ sở di truyền học của sự lan truyền gen đề kháng kháng sinh ở
Acinetobacter baumannii………………………………………………………. 14
1.3. ĐỀ KHÁNG CARBAPENEM DO CARBAPENEMASE Ở
ACINETOBACTER BAUMANNII……………………………………………………….. 17
1.3.1. Phân loại và cơ chế hoạt động của carbapenemase ………………….. 17
1.3.2. Một số loại carbapenemase lớp B và D thường gặp ở A. baumannii .. 19
1.3.3. Nghiên cứu gen mã hóa carbapenemase và tình hình đề kháng
carbapenem của A. baumannii tại Việt Nam …………………………….. 27
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KIỂU GEN VÀ
CARBAPENEMASE Ở A. BAUMANNII …………………………………………….. 31
1.4.1. Phương pháp phát hiện gen mã hóa carbapenemase…………………. 31
1.4.2. Phương pháp kiểu hình phát hiện carbapenemase ……………………. 32
1.4.3. Phương pháp sinh hóa xác định hoạt tính enzyme carbapenemase … 37
1.4.4. Một số phương pháp nghiên cứu khả năng lan truyền của các
chủng vi khuẩn mang gen đề kháng kháng sinh ở mức độ phân tử.. 40
1.5. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN…………………………………………….. 41Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………… 42
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………………… 42
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………………. 42
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ……………………………………………………………. 42
2.2.2. Chọn mẫu và cỡ mẫu ………………………………………………………….. 42
2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………. 43
2.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ………………………………… 44
2.5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU………………………………………………………… 44
2.5.1. Thu thập và lưu giữ mẫu nghiên cứu……………………………………… 44
2.5.2. Kỹ thuật PCR phát hiện gen blaOXA-51-like ở các chủng A. baumannii…. 44
2.5.3. Kỹ thuật xác định nồng tối thiểu ức chế vi khuẩn phát triển
(Minimum Inhibitory Concentrations – MIC) của kháng sinh ………… 46
2.5.4. Kỹ thuật PCR phát hiện một số gen mã hóa carbapenemase lớp D
và B ở A. baumannii…………………………………………………………….. 50
2.5.5. Xác định kiểu gen của vi khuẩn bằng kỹ thuật điện di xung
trường (Pulsed-field gel electrophoresis -PFGE) ………………………. 54
2.5.6. Một số thử nghiệm phát hiện sinh carbapenemase ở A. baumannii …. 55
2.6. XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU ……………………………………………… 59
2.7. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU …………………………………………………………. 60
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………………… 61
3.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA
CARBAPENEM VỚI CÁC CHỦNG A. BAUMANNII ………………………….. 61
3.1.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu……………………………………………. 61
3.1.2. Xác định MIC của carbapenem với các chủng A. baumannii …….. 62
3.2. PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN MÃ HÓA CARBAPENEMASE LỚP D,
B CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII……………………………………………. 70
3.2.1. PCR phát hiện một số gen mã hóa carbapenemase…………………… 70
3.2.2. Xác định mối liên hệ kiểu gen PFGE và kiểu hình đề kháng
kháng sinh của các chủng A. baumannii ………………………………….. 783.3. XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA MIC VỚI SỰ XUẤT HIỆN
CARBAPENEMASE VÀ GEN MÃ HÓA CARBAPENEMASE ……………. 84
Chương 4. BÀN LUẬN …………………………………………………………………… 90
4.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA
CARBAPENEM VỚI CÁC CHỦNG A. BAUMANNII ………………………….. 90
4.1.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu……………………………………………. 90
4.1.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của carbapenem với các chủng
A. baumannii ………………………………………………………………………. 92
4.2. PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN MÃ HÓA CARBAPENEMASE LỚP D,
B Ở ACINETOBACTER BAUMANNII ………………………………………………. 102
4.2.1. PCR xác định một số gen mã hóa carbapenemase lớp D, B …….. 102
4.2.2. Mối liên hệ kiểu gen PFGE và kiểu hình đề kháng kháng sinh của
các chủng A. baumannii………………………………………………………. 106
4.3. MỐI LIÊN QUAN GIỮA MIC VỚI SỰ XUẤT HIỆN CARBAPENEMASE
VÀ GEN MÃ HÓA CARBABENEMASE ………………………………………… 109
KẾT LUẬN………………………………………………………………………………….. 120
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ………………………………….. 121
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO………………….. 122
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại beta-lactamase theo chức năng tương quan với cấu
trúc phân tử……………………………………………………………………. 18
Bảng 1.2. Một số loại carbapenemase lớp D, B thường gặp ở A. baumannii…20
Bảng 1.3. Khả năng thủy phân KS của một số loại OXA ở A. baumannii. 22
Bảng 2.1. Trình tự mồi đặc hiệu cho gen blaOXA-51-like…………………………. 45
Bảng 2.2. Nồng độ các kháng sinh pha loãng bậc 2 ……………………………. 47
Bảng 2.3. Các đoạn mồi đặc hiệu phát hiện gen kháng carbapenem………. 51
Bảng 3.1. Phân bố chủng nghiên cứu theo bệnh viện và vùng miền………. 61
Bảng 3.2. Phân bố số chủng nghiên cứu theo loại mẫu bệnh phẩm ……….. 62
Bảng 3.3. Tỷ lệ A. baumannii đề kháng với carbapenem …………………….. 62
Bảng 3.4. Giá trị MIC của kháng sinh với các chủng A. baumanni ……….. 63
Bảng 3.5. Mức độ đề kháng của chủng nghiên cứu theo vùng miền………. 64
Bảng 3.6. Giá trị MIC của một số kháng sinh ở 2 nhóm CSAB và CRAB … 65
Bảng 3.7. Tỷ lệ các chủng A. baumannii dương tính với ISAba1………….. 71
Bảng 3.8. Tỷ lệ carbapenemase dương tính theo từng kỹ thuật …………….. 85
Bảng 3.9. Mối liên quan giữa MIC với carbapenemase dương tính theo
từng kỹ thuật………………………………………………………………….. 86
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa gen mã hóa carbapenemase với carbapenemase
dương tính theo từng kỹ thuật…………………………………………… 87
Bảng 3.11. Mối liên quan giữa MIC với sự xuất hiện carbapenemase và
gen mã hóa carbapenemase ở A. baumannii………………………… 88DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1.1. Phân bố căn nguyên gây VAP theo mức thu nhập của các nước.10
Biểu đồ 3.1. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của carbapenem đối với các
chủng A. baumannii…………………………………………………….. 65
Biểu đồ 3.2. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của cefepime ở 2 nhóm CSAB
và CRAB …………………………………………………………………… 66
Biểu đồ 3.3. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của ceftazidime ở 2 nhóm
CSAB và CRAB …………………………………………………………. 67
Biểu đồ 3.4. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của amikacin ở 2 nhóm CSAB
và CRAB …………………………………………………………………… 67
Biểu đồ 3.5. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của levofloxacin ở 2 nhóm
CSAB và CRAB …………………………………………………………. 68
Biểu đồ 3.6. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của minocyclin ở 2 nhóm
CSAB và CRAB …………………………………………………………. 68
Biểu đồ 3.7. Phân bố tỷ lệ (%) giá trị MIC của colistin ở 2 nhóm CSAB
và CRAB …………………………………………………………………… 69
Biểu đồ 3.8. Tỷ lệ gen mã hóa carbapenemae phát hiện được ở các chủng
A. baumannii ……………………………………………………………… 70
Biểu đồ 3.9. Tỷ lệ tổ hợp các gen mã hóa carbapenemase ở các chủng
A. baumannii ……………………………………………………………… 70
Biểu đồ 3.10. Tỷ lệ các gen mã hóa carbapenemase ở 2 nhóm CSAB và
CRAB……………………………………………………………………….. 76
Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii
mang 1 và ≥ 2 gen mã hóa carbapenemase………………………. 76
Biểu đồ 3.12. Tỷ lệ giá trị MIC của carbapenem giữa 2 nhóm mang
blaOXA-23-like có và không có ISAba1/blaOXA-23-like………………. 77
Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ các gen mã hóa carbapenemase ở các chủng
A. baumannii theo vùng miền ……………………………………….. 77
Biểu đồ 3.14. Tỷ lệ cac gen mã hóa carbapenemase ở các chủng A.
baumannii theo tuyến bệnh viện ……………………………………. 78DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của beta-lactam ……………………………………….. 3
Hình 1.2: Hình thái và tính chất nhuộm Gram của A. baumannii……………. 6
Hình 1.3: Thời gian KS được đưa vào sử dụng trên lâm sàng ( ) và thời
điểm xuất hiện Acinetobacter đề kháng KS (■) …………………… 13
Hình 1.4. Tn 2006 với ISAba1 ở trước và sau của gen blaOXA-23 ở
A. baumannii …………………………………………………………………. 15
Hình 1.5. Cơ chế tác động của beta-lactamase…………………………………… 19
Hình 1.6. Hình ảnh thử nghiệm MHT………………………………………………. 33
Hình 1.7. Sơ đồ quy trình kỹ thuật CIM …………………………………………… 34
Hình 1.8. Kỹ thuật E-test MBL ………………………………………………………. 36
Hình 1.9. Kỹ thuật khoanh giấy hiệp đồng phát hiện MBL………………….. 36
Hình 1.10. Hình ảnh thử nghiệm CarbaNP …………………………………………. 38
Hình 2.1. Phiến inox 32 giếng và bộ đinh cấy …………………………………… 47
Hình 2.2. Sơ đồ vị trí mẫu trên phiến inox 32 giếng …………………………… 48
Hình 2.3. Hình ảnh đĩa 96 giếng……………………………………………………… 49
Hình 2.4. Hình ảnh kỹ thuật MHT…………………………………………………… 56
Hình 2.5: Hình ảnh thử nghiệm CarbaNP …………………………………………. 58
Hình 2.6. Hình ảnh kết quả của kỹ thuật CIM …………………………………… 59
Hình 3.1. Hình ảnh cho kỹ thật xác định MIC pha loãng trong thạch ……. 63
Hình 3.2. Hình ảnh kỹ thuật xác định MIC đối với colistin …………………. 69
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen blaOXA của các
chủng A. baumannii………………………………………………………… 71
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen blaNDM-1 của các
chủng A. baumannii………………………………………………………… 72
Hình 3.65. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen ISAba1 và
ISAba1/blaOXA-23 của các chủng A. baumannii …………………….. 72Hình 3.6. Kết quả đại diện so sánh giải trình tự sản phẩm PCR gen blaOXA-
51-like với trình tự gen chuẩn ………………………………………………. 73
Hình 3.7. Kết quả đại diện so sánh giải trình tự sản phẩm PCR gen
ISAba1/blaOXA-23-like với trình tự gen chuẩn ………………………….. 74
Hình 3.8. Hình ảnh đại diện cho kiểu gen PFGE của A.baumannii……….. 78
Hình 3.9. Mối liên hệ kiểu gen của 144 chủng A. baumannii phân lập tại
9 bệnh viện ……………………………………………………………………. 81
Hình 3.10. Kiểu hình đề kháng ở các cụm có kiểu gen PFGE tương đồng.. 83
Hình 3.11. Ảnh kết quả đại diện thử nghiệm MHT (trái) và THT (phải) …. 84
Hình 3.12. Ảnh kết quả đại diện cho kỹ thuật CarbAcineto NP……………… 8

Một số gen mã hoá cacbapenemase và mối liên quan với mức độ kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii tại Việt Nam

Leave a Comment Cancel reply