Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư

Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L..Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26].

Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo quản. Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể được áp dụng. Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể người bệnh [58]. Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu.
Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [116]. Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44].
Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm:
1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm;
2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm;
3. Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat;
4. Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu phân nano artesunat

MỤC LỤC Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………………………………..1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN………………………………………………………………………………….2
1.1. Đại cƣơng về artesunat ………………………………………………………………………………2
1.1.1. Công thức…………………………………………………………………………………… 2
1.1.2. Tính chất vật lý ……………………………………………………………………………. 2
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat…………………………….. 2
1.1.4. Các phương pháp định lượng artesunat …………………………………………….. 4
1.1.5. Tác dụng ức chế tế bào ung thư……………………………………………………….. 5
1.1.6. Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư………………………………………… 8
1.2. Tiểu phân nano polyme………………………………………………………………………………9
1.2.1. Đặc điểm ……………………………………………………………………………………. 9
1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme…………………………. 10
1.2.3. Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA bằng
chitosan hoặc PEG……………………………………………………………………………………. 11
1.2.4. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano…………. 14
1.2.5. Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm……………………….. 18
1.2.6. Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng hóa bề mặt bằng
cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa ………………………………………………………… 19
1.3. Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thƣ ……………………………..25
1.3.1. Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc
nano………………………………………………………………………………………………………. 25
1.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano ……………….. 26
1.3.3. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư…………………. 271.3.4. Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano
chứa dẫn chất của artemisinin……………………………………………………………………… 28
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………..33
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………………………………….33
2.1.1. Nguyên liệu ………………………………………………………………………………. 33
2.1.2. Tế bào và động vật thí nghiệm………………………………………………………. 34
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu …………………………………………………………………….. 34
2.2. Địa điểm nghiên cứu…………………………………………………………………………………35
2.3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………………………………36
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………………………………….36
2.4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat …………………………………………………… 36
2.4.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ……………………….. 41
2.4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat …………….. 46
2.4.4. Đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat…………………………………………………………………………………………………. 47
2.4.5. Theo dõi độ ổn định ……………………………………………………………………. 52
2.4.6. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo…………………. 53
2.4.7. Xử lý số liệu ……………………………………………………………………………… 56
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………………………57
3.1. Kết quả bào chế tiểu phân nano artesunat…………………………………………………57
3.1.1. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi
dung môi và hấp phụ vật lý ………………………………………………………………………… 57
3.1.2. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp phun điện
trường ……………………………………………………………………………………………………. 64
3.1.3. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG ……………………………………….. 69
3.2. Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat …………………80
3.2.1. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS ………………………………………….. 80
3.2.2. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG………………………………………… 84
3.3. Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat……..88
3.3.1. Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat …………………………. 88
3.3.2. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg ……. 933.4. Kết quả đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân
nano artesunat………………………………………………………………………………………………..95
3.4.1. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95
3.4.2. Hình thái của tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô ……………… 96
3.4.3. Phổ nhiễu xạ tia X………………………………………………………………………. 96
3.4.4. Phân tích phổ hồng ngoại …………………………………………………………….. 97
3.4.5. Phân tích nhiệt vi sai …………………………………………………………………… 98
3.4.6. Khả năng giải phóng hoạt chất in vitro ……………………………………………. 98
3.5. Kết quả đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của bột đông khô pha tiêm
chứa tiểu phân nano artesunat………………………………………………………………………..99
3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat…………………………………………………………………………………………………. 99
3.5.2. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat….. 100
3.5.3. Độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau khi phân tán lại
…………………………………………………………………………………………………………… 105
3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế
khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat …………………………………………………..106
3.6.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro của tiểu phân nano
artesunat……………………………………………………………………………………………….. 106
3.6.2. Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat….. 110
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………..113
4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat……………………………………………………………113
4.1.1. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan ………………………………. 113
4.1.2. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG……………………………………. 119
4.2. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat………………………124
4.2.1. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan ………………………………. 124
4.2.2. Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG……………………………………. 126
4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat………………..128
4.4. Đánh giá các đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đông khô …………………………….133
4.5. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm…………………………………………………….136
4.6. Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và in vivo ……………………………………1384.6.1. Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro…………………………………………. 138
4.6.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo………………………………………….. 141
4.7. Đóng góp mới của luận án ………………………………………………………………………146
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………………………………..147
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤCDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
AFM Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy)
ART Artesunat
ATN Artemisinin
ATNs Artemisinin và dẫn chất
C6 Coumarin 6
CD Cyclodextrin
CS Chitosan
DCM Dicloromethan
DHA Dihydroartemisinin
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Acid deoxyribonucleic
DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry)
EPR Hiệu ứng tăng tính thấm và lưu giữ (Enhanced Permeability and
Retention effect)
FDA Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug
Administration)
FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared
Spectroscopy)
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
i.p. Đường tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection)
i.v. Đường tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection)
KTTP Kích thước tiểu phân trung bình theo cường độ (Z-Average,
Intensity Distribution)
LC-MS Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)
LLC Ung thư phổi Lewis ở chuột (Lewis Lung Cancer)MPS Hệ thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System)
NP/s Tiểu phân nano (Nanoparticle/s)
PBS Phosphat Buffer Salin
PDI Hệ số đa phân tán (Polydispersity Index)
PEG Poly ethylen glycol
PLGA Acid poly(lactic-co-glycolic)
PL Phụ lục
PM Hỗn hợp vật lý (Physical mixture)
RES Hệ lưới nội mô (Reticulo-Endothelial System)
ROS Các gốc oxy hoạt động (Reactive Oxygen Species)
SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy)
SRB Sulforhodamine B
TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron
Microscopy)
TP nano Tiểu phân nano
XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction)DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên chuột
của artemisinin và dẫn chất …………………………………………………………………………………6
Bảng 1.2. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư ……………………27
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng ……………………………………………..33
Bảng 3.1. Ký hiệu và các mức của biến độc lập……………………………………………………59
Bảng 3.2. Ký hiệu, các mức của biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa …………………60
Bảng 3.3. Các công thức thực nghiệm và đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS
………………………………………………………………………………………………………………………60
Bảng 3.4. Công thức tối ưu của TP nano ART/PLGA-CS……………………………………..63
Bảng 3.5. Kết quả một số đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS bào chế theo
công thức tối ưu (n=3) ………………………………………………………………………………………63
Bảng 3.6. Các mức và thông số thiết yếu của quá trình phun điện trường kép tạo TP
nano nhân – vỏ ART/PLGA-CS …………………………………………………………………………64
Bảng 3.7. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập ……………………………………………..72
Bảng 3.8. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa ………………………..72
Bảng 3.9. Các công thức thực nghiệm bào chế TP nano ART/PLGA-PEG ……………..73
Bảng 3.10. Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0…………………………………77
Bảng 3.11. Một số đặc tính TP nano bào chế theo công thức tối ưu (n=3)……………….78
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART …………………..79
Bảng 3.13. So sánh một số đặc điểm của quá trình bào chế các TP nano PLGA bao CS
hay PEG………………………………………………………………………………………………………….88
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô …….89
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thể tích đến hình thức sản phẩm đông khô……………………92
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời gian đông khô đến chất lượng sản phẩm ……………….93
Bảng 3.17. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART…………….95
Bảng 3.18. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART
…………………………………………………………………………………………………………………….100
Bảng 3.19. Chỉ tiêu hình thức, thời gian phân tán lại của bột đông khô sau thời gian
bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ……………………..101Bảng 3.20. Hàm lượng nước, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân sau
khi phân tán lại của bột đông khô chứa TP nano ART bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và
ở điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) (n=3)…………………………………………………………102
Bảng 3.21. Phần trăm hàm lượng ART, giới hạn tạp chất và độ vô khuẩn trong bột
đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC …………………………………………………………….103
Bảng 3.22. Độ ổn định của hỗn dịch chứa TP nano ART sau khi phân tán lại trong 4
giờ ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ……………………………..106
Bảng 3.23. Giá trị IC50 của các công thức bao PEG đối với tế bào LLC……………….110
Bảng 3.24. Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm khi dùng đường tiêm tĩnh mạch
đuôi (n=6) ……………………………………………………………………………………………………..110
Bảng 3.25. Sự phát triển của khối u khi tiêm tĩnh mạch đuôi ……………………………….111DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART ………………………………………………………………….2
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS ………………………..37
Hình 2.2. Minh họa quá trình phun điện trường kép trong bào chế TP nano dạng nhân
– sợi ……………………………………………………………………………………………………………….38
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến…………………………………….40
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình bào chế TP nano ART/PLGA-PEG sử dụng PLGA-PEG…40
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm
chứa TP nano ART trên mô hình chuột gây u bằng dòng tế bào LLC khi dùng đường
tiêm tĩnh mạch đuôi ………………………………………………………………………………………….56
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS và PLGA tới KTTP và thế zeta của TP nano ART
(n=3) ………………………………………………………………………………………………………………57
Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH dung dịch CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ………………………………………………………………………………………58
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ hấp phụ CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ………………………………………………………………………………………59
Hình 3.4. Hình ảnh mặt đáp của KTTP ở các điều kiện khác nhau: khi nhiệt độ = 25oC
(A), khi pH của dung dịch CS = 4,0 (B), và khi tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) = 0,6; và của thế
zeta của TP nano ART/PLGA-CS khi pH của dung dịch CS = 4,0. ………………………..62
Hình 3.5. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM1-FM4 ……………………………………………………………………………………………………….65
Hình 3.6. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM5-FM8 ……………………………………………………………………………………………………….66
Hình 3.7. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM9-FM12 ……………………………………………………………………………………………………..67
Hình 3.8. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức:
FM13-FM16 ……………………………………………………………………………………………………68
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG……………………………………………………………………………………………..69
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG……………………………………………………………………………………………..70Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG……………………………………………………………………………………………..71
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/nước đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG……………………………………………………………………………………………..71
Hình 3.13. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến KTTP của TP nano
ART/PLGA-PEG……………………………………………………………………………………………..74
Hình 3.14. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến PDI của TP nano
ART/PLGA-PEG……………………………………………………………………………………………..75
Hình 3.15. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến tỷ lệ nạp thuốc của
TP nano ART/PLGA-PEG ………………………………………………………………………………..77
Hình 3.16. Hình ảnh TEM của TP nano ART/PLGA-CS………………………………………80
Hình 3.17. Phổ hồng ngoại của ART, CS, PLGA, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-CS ……………………………………………………………………………………………….80
Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA và
ART/PLGA-CS (n=3) ………………………………………………………………………………………81
Hình 3.19. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột ART và TP nano
ART/PLGA-CS (công thức FM15, ký hiệu NPs) (n= 3) ……………………………………….83
Hình 3.20. Hình ảnh chụp SEM của TP nano ART/PLGA-PEG…………………………….84
Hình 3.21. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-PEG (NPs) ……………………………………………………………………………………84
Hình 3.22. Phổ hồng ngoại của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP
nano ART/PLGA-PEG (NPs)…………………………………………………………………………….85
Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của TP nano ART/PLGA-PEG trong CDCl3, D2O …………..86
Hình 3.24. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA-PEG và
TP nano ART/PLGA (n=3) ……………………………………………………………………………….87
Hình 3.25. Ảnh hưởng của các tá dược tạo bánh đến sản phẩm sau đông khô (A) và
sau khi phân tán lại (B)……………………………………………………………………………………..89
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ saccarose và manitol đến KTTP và PDI trước và
sau khi đông khô (n=3)……………………………………………………………………………………..90
Hình 3.27. Ảnh hưởng kết hợp tá dược tạo bánh khác nhau đến chất lượng sản phẩm
đông khô (n=3) ………………………………………………………………………………………………..91
Hình 3.28. Hình ảnh bánh bị phồng rộp (A) và bánh còn ướt đáy (B và C) ……………..9