Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm

Luận án Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm. Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ. Mặc dù chỉ gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và tế bào sừng nhƣng việc tái tạo khi da bị tổn thƣơng vẫn còn là một thách thức [2],[8]. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ tế bào da nuôi cấy đã đƣợc ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn tính [6],[17],[18]… Mặc dù hạn chế đƣợc nguy cơ lây nhiễm nhƣng do khả năng tăng sinh có hạn và tính kích thích đào thải miễn dịch của tế bào cao nên chi phí giá thành vật liệu lớn làm hạn chế khả năng phổ biến ứng dụng trong điều trị. Hơn nữa, thành phần các loại vật liệu chỉ là nguyên bào sợi hoặc tế bào sừng nên còn thiếu rất nhiều các thành phần phụ của da nhƣ tế bào sắc tố, tế bào nang lông, tế bào tuyến bã… Việc khắc phục các hạn chế trên đang đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chƣa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới.

Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn, mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan [14],[42]. Các tế bào này có thể đƣợc nuôi cấy và nhân lên in vitro và dƣới các điều kiện thích hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xƣơng, sụn, cơ và mỡ.
Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi là dạng tế bào quan trọng cho công nghệ mô [26],[43]. Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau. Tủy xƣơng là nguồn chính của tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn và số lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng cũng hạn chế [14],[52]. Do sự tăng lên về tuổi  tác, khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau của tế bào gốc trung mô tủy xƣơng bị giảm đi và các tế bào cũng đặt ra câu hỏi về nguy cơ nhiễm virus [44]. Những vấn đề cần cân nhắc này đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xƣong. Hơn nữa, cùng với sự tăng lên về tuổi tác của ngƣời cho, số lƣợng tế bào gốc trung mô trƣởng thành trong đó các tế bào gốc trung mô tủy xƣơng cũng bị giảm đi đáng kể. Các dữ liệu trƣớc đây đã chỉ ra rằng số lƣợng tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ở ngƣời 80 tuổi giảm đi 200 lần so với trẻ mới sinh [45],[63].
Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm.Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã đƣợc quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Dây rốn là mô mềm có chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh dƣỡng…cho thai. Tế bào gốc đa năng đã đƣợc phát hiện và tách từ những phần khác nhau của dây rốn. Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ [1],[57].
Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tƣơng đối dƣ thừa. Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hƣởng cúa các vấn đề vềđạo đức và luật pháp [14],[109]. Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc từ màng dây rốn. Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng chƣa hề bị biệt hoá, vẫn giữ đƣợc đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập [58],[59], [60],[61].Từ những cơ sở lý luận trên, cùng với nhu cầu thực tiễn điều trị bỏng -vết thƣơng, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm các mục tiêu:
1. Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn.
2. Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình
Danh mục ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………….. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………….. 3
1.1. QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG, VẾT BỎNG …………………………. 3
1.1.1. Diễn biến lâm sàng vết thƣơng, vết bỏng sâu ……………………………. 3
1.1.2. Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng …………………………….. 5
1.2. GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG…………………………………. 12
1.2.1. Vật liệu tƣơng đƣơng trung bì có tế bào …………………………………. 12
1.2.2. Vật liệu tƣơng đƣơng biểu bì có tế bào …………………………………… 13
1.2.3. Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp có tế bào ………………………………. 14
1.3. TẾ BÀO GỐC, TIỀM NĂNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC …. 16
1.3.1. Tế bào gốc, đặc tính và phân loại tế bào gốc …………………………… 16
1.3.2. Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh ………………………………… 19
1.3.3. Các tiềm năng ứng dụng tế bào gốc ……………………………………….. 21
1.3.4. Biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào da dùng trong điều trị vết
thƣơng …………………………………………………………………………………………. 24
1.4. DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN … 28
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 33
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………………… 33
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU …………… 33
2.2.1. Mẫu mô dây rốn ………………………………………………………………….. 33
2.2.2. Hóa chất chủ yếu dùng trong nghiên cứu ……………………………….. 34
2.2.3. Các vật tƣ tiêu hao chủ yếu …………………………………………………… 35
2.2.4. Các thiết bị và dụng cụ chủ yếu …………………………………………….. 35
2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì. ………………… 36
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………………… 36
2.3.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt hóa
tế bào ………………………………………………………………………………………….. 36
2.3.2. Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả ghép tế bào điều trị vết thƣơng
thực nghiệm …………………………………………………………………………………. 47
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU ……………………………………………………………………….. 55
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………………………… 56
3.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP, NUÔI CẤY BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN ……………………………………………………….. 56
3.1.1. Đặc điểm phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn ……………………… 56
3.1.2. Biểu hiện kháng nguyên hòa hợp tổ chức và tính sinh miễn dịch
của tế bào gốc trung mô dây rốn …………………………………………………….. 62
3.1.3. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào sợi ……. 67
3.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN
TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM …… 76
3.2.1. Thay đổi một số chỉ số toàn thân và xét nghiệm của thỏ trong ghép
tế bào gốc trung mô ………………………………………………………………………. 76
3.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng …… 79
3.2.3. Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm ……………………………. 88
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN …………………………………………………………………. 92
4.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC
TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN . …………………………………………………….. 92
4.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn ……………………………. 92
4.1.2. Một số đặc tính của tế bào gốc trung mô dây rốn …………………….. 94
4.1.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành dạng nguyên bào sợi 97
4.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ ĐIỀU TRỊ VẾT
BỎNG THỰC NGHIỆM ………………………………………………………………… 101
4.2.1. Mô hình nghiên cứu ghép tế bào gốc trung mô dây rốn ………….. 101
4.2.2. Tác động của ghép tế bào gốc trung mô trên quá trình liền vết
thƣơng thực nghiệm ……………………………………………………………………. 102
4.2.3. Những ảnh hƣởng bất lợi của ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung
bì đến tình trạng toàn thân và nhiễm khuẩn vết thƣơng ……………………. 113
KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………….. 117
KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………………………………. 119
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ
1 BC Bạch cầu
2 BM Biểu mô
3 CLMC Cord lining messenchymal cell
(Tế bào gốc trung mô màng dây rốn)
4 CT Công thức
5 D0 Ngày bắt đầu nghiên cứu
6 D5, D10 Ngày nghiên cứu thứ 5, thứ 10
7 DT Diện tích
8 ĐVDT Đơn vị diện tích
9 GF Growth factor (Yếu tố tăng trƣởng)
10 HC Hồng cầu
11 HLA Human leukocyte antigens
(Kháng nguyên hòa hợp mô)
12 MI Mitose index (Chỉ số phân bào)
13 NBS Fibroblast (Nguyên bào sợi )
14 SL Số lƣợng
15 TB Tế bào
16 TBG Tế bào gốc
17 TBGTM Tế bào gốc trung mô
18 TBGTMDR Tế bào gốc trung mô màng dây rốn
19 TBS Keratinocyte (Tế bào sừng)
20 TBV Tế bào viêm
21 VK Vi khuẩn
22 VT Vết thƣơng
DANH MỤC BẢNG
Bảng Tên Bảng Trang
3.1. Tỷ lệ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm khi xử lý và cấy mô ………………….. 56
3.2. Thời gian tế bào tách ra khỏi mẫu mô và đạt 50% che phủ ………….. 57
3.3. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô ở P2 …………………….. 60
3.4. Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua các thế hệ tế bào ………………. 67
3.5. Phân tích hình thái và nhận xét sự biến đổi hình thái tế bào
trong quá trình biệt hóa qua các thế hệ tế bào …………………………….. 68
3.6. Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa ……………………………………… 70
3.7. Hàm lƣợng collagen hòa tan (µg/ml) …………………………………………. 72
3.8. Thay đổi các chỉ số huyết học thỏ nghiên cứu …………………………….. 77
3.9. Thay đổi các chỉ số sinh hoá máu liên quan chức năng thận …………. 78
3.10. Hoạt độ enzym GOT, GPT huyết thanh …………………………………….. 78
3.11. Diễn biến lâm sàng vết thƣơng bỏng thực nghiệm ………………………. 79
3.12. Thay đổi diện tích vết thƣơng bỏng …………………………………………… 80
3.13. Tốc độ liền vết thƣơng …………………………………………………………….. 80
3.14. Liên quan thời gian và số vết thƣơng liền hoàn toàn …………………… 81
3.15. Diện tích vùng biểu mô hóa sau khi liền ……………………………………. 81
3.16. Đặc điểm hình thái cấu trúc mô vết thƣơng tại các thời điểm ……….. 84
3.17. Thay đổi số lƣợng tế bào viêm tại mô vết thƣơng ……………………….. 85
3.18. Thay đổi số lƣợng nguyên bào sợi tại mô vết thƣơng ………………….. 85
3.19. Thay đổi số lƣợng tân mạch tại mô vết thƣơng …………………………… 86
3.20. Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thƣơng …………………. 86
3.21. Tần xuất xuất hiện vi khuẩn qua các thời điểm nghiên cứu ………….. 88
3.22. Thay đổi mật độ Số lƣợng vi khuẩn vết thƣơng …………………………. 90
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ Tên Biểu đồ Trang
3.1. Thời gian tế bào mọc ra khỏi mẫu mô và thời gian thu tế bào. ……… 57
3.2. Kết quả phân tích bằng flowcytometry mức độ biểu hiện
HLA-DR của TBGTM màng dây rốn. ………………………………………. 63
3.3. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên
siêu nghiền bằng xét nghiệm ELISA …………………………………………. 64
3.4. Phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên là
tế bào nguyên vẹn …………………………………………………………………… 65
3.5. So sánh khả năng phát hiện kháng thể thỏ kháng tế bào gốc
với kháng nguyên là tế bào siêu nghiền và tế bào nguyên vẹn ……… 66
3.6. Thay đổi cân nặng thỏ nghiên cứu …………………………………………….. 76
3.7. Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng nghiên cứu (Vùng A) ………… 89
3.8. Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng đối chứng (Vùng B) ………….. 89
3.9. Thay đổi số lƣợng vi khuẩn tại vết bỏng ……………………………………. 91
DANH MỤC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1. Sự tăng sinh của nguyên bào sợi trong các giai đoạn khác
nhau của quá trình liền vết thƣơng ………………………………………….. 11
1.2. Các loại tế bào gốc theo nguồn gốc và thời điểm phân lập …………. 18
1.3. Khả năng nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc ………………………………. 21
1.4. Khả năng ứng dụng trị liệu tế bào gốc ……………………………………… 22
1.5. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc tủy xƣơng …………………………….. 23
1.6. Khả năng ứng dụng trị liệu của tế bào gốc mỡ ………………………….. 23
1.7. Dây rốn, mô kết nối ngƣời mẹ và thai nhi ………………………………… 28
1.8. Nguồn lấy tế bào gốc dây rốn …………………………………………………. 30
2.1. Cấu trúc mô dây rốn ……………………………………………………………… 38
2.2. Dụng cụ gây bỏng thực nghiệm trên thỏ ………………………………….. 49
DANH MỤC ẢNH
Ảnh Tên ảnh Trang
3.1. Tế bào mọc ra khỏi mẫu mô ở ngày thứ 10 sau cấy mô. …………….. 58
3.2. Tế bào mọc ra khỏi mẫu mô sau 14 ngày cấy mô ……………………… 58
3.3. Hình ảnh nhân và bào tƣơng bình thƣờng của tế bào trung mô
mới tách ra khỏi mô dây rốn. ………………………………………………….. 59
3.4. Các colony có từ 3-5 tế bào đƣợc quan sát sớm vào ngày thí
nghiệm thứ 05. ……………………………………………………………………… 61
3.5. Các colony do các tế bào gốc trung mô màng dây rốn tạo nên
vào ngày thí nghiệm tạo thứ 20. ……………………………………………. 61
3.6. Kháng nguyên HLA-G và HLA-E có trong dịch nghiền tế bào
gốc trung mô màng dây rốn đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật
western blot. …………………………………………………………………………. 62
3.7. Biến đổi hình thái tế bào ngày thứ 7 trong quá trình biệt hóa. …….. 67
3.8. Biến đổi hình thái tế bào. ……………………………………………………….. 69
3.9. Hình dạng tế bào và bào tƣơng tế bào biệt hóa dạng nguyên
bào sợi, tế bào dạng hình thoi, dài ………………………………………….. 70
3.10. Hình dạng nhân và bào tƣơng tế bào biệt hóa dạng nguyên
bào sợi. Tế bào dạng hình thoi, dài nhân hình trứng …………………. 71
3.11. Hình thái siêu cấu trúc ảnh tế bào biệt hóa. ………………………………. 71
3.12. Tế bào mọc thành hai lớp đan chéo nhau ở ngày thứ 5 ………………. 73
3.13. Duy trì môi trƣờng nuôi cấy 2 tuần …………………………………………. 74
3.14. Hình ảnh đại thể tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì. …………………. 75
3.15. Vết bỏng sâu ngày thứ 5 sau bỏng đã đƣợc cắt lọc sạch hoại
tử, chuẩn bị ghép tế bào gốc trung mô.. …………………………………… 82
3.16. Vết bỏng ở ngày nghiên cứu thứ 5 ………………………………………….. 82
Ảnh Tên ảnh Trang
3.17. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 15 ……………………………………………. 83
3.18. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 20. …………………………………………… 83
3.19. Hình thái cấu trúc mô vết thƣơng vùng A trƣớc ghép tế bào ………. 87
3.20. Vết thƣơng vùng A ngày nghiên cứu thứ 5. ……………………………… 87
3.21. Mô vết thƣơng vùng A ở ngày nghiên cứu thứ 10 …………………….. 88