Nghiên cứu biểu hiện proinsulin người trên Vector Pet 28a(+) trong tế bào Escherichia Coli bl21 (de3)

Proinsulin là một protein tiền thân của insulin. Dưới tác dụng thuỷ phân của các enzym tuyến tuỵ (endopeptidases: PC1, PC2, PC3) proinsulin tạo thành insulin [2]. Thiếu hụt insulin sẽ dẫn đến bệnh đái tháo đường [1], một bệnh phổ biến và mang tính xã hội cao, bệnh không chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ mà còn gây ảnh hưởng đến sự phát triển của nền kinh tế bởi chi phí điều trị tốn kém vì kéo dài cả đời. Insulin tái tổ hợp đã được các công ty dược phẩm lớn trên thế giới giữ bản quyền về nghiên cứu sản xuất, việc nghiên cứu và tự sản xuất được insulin như một dược phẩm không chỉ đem đến lợi ích về  công  nghệ  mà  còn lợi về kinh tế lâu dài. Nghiên cứu biểu hiện protein tiền insulin (proinsulin) nhằm mục tiêu:

Bước đầu phục vụ cho nhu cầu sản xuất chế phẩm insulin tái tổ hợp.

I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu

cDNA tuyến tuỵ người, sản phẩm của hãng Ambion, Mỹ. Cặp mồi khuyếch đại gen proinsulin dài 28 bp (Pins-Fw: cgc gga tcc atg ttt gtg aac caa, Pins-Rv: ccg ctc gag gtt gca gta att ctc), hệ thống vector biểu hiện pET 28a(+) của hãng Novagen có kích thước 5369 bp, có điểm khởi đầu phiên mã của pBR322, gen kháng kanamicin, chứa promoter lac được điều hoà bằng IPTG (isopropyl -D thioglactoside). Chủng tế bào E.coli DH5d được dùng để nhân bản plasmid. Chủng E. coli BL21 (DE3) được dùng để biểu hiện proinsulin. Enzym giới hạn được lựa chọn theo thiết kế mồi và vector là Bam HI và Xho I của hãng Invitrogen.

2. Phương pháp

2.1 Khuyếch đại gen proinsulin.

Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi Pins trên hệ thống GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem) với công thức cho 25μl phản ứng là  0,4μM cho mỗi mồi, 5μl đệm 5X, 1μM dNTPs, 1μl Taq polymease, 1μl cDNA và thêm nước đủ đến 25μl. Điều kiện cho phản ứng 950C trong 5 phút, 35 chu kỳ: 950C trong 30 giây, 520C trong 30 giây, 720C trong 60 giây và một chu kỳ: 720C 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% đồng thời  thu lại sản phẩm, làm sạch  sản  phẩm  bằng  kít  “PCR  purification  kit “ (QIAgen) để dùng cho nhân dòng.

Thiết kế plasmid mang gen proinsulin

Để tạo được plasmid tái tổ hợp mang gen tổng hợp proinsulin thì việc trước tiên phải xử lý vector pET 28a và sản phẩm PCR tinh sạch với enzym giới hạn Bam HI và Xho I sau đó được điện di toàn bộ trên gel agarose 1,5%, cắt băng sản phẩm trên gel và tinh sạch bằng bộ kít: “Gel extraction kit” của QIAgen, sản phẩm này được dùng để tạo plas- mid mang gen proinsulin tại vị trí cắt của Bam HI và Xho I.

Tạo dòng E. coli DH5 mang plasmid tái tổ hợp

Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào E. coli  DH5  bằng phương pháp sốc nhiệt (420C trong 42 giây). E. coli mang plasmid tái tổ hợp được sàng lọc bằng cách  cấy trên môi trường thạch  có  kanamicin 50μg/ml. Plasmid thu nhận được ký hiệu là pET-PINS.

Tuyển chọn thể biến nạp bằng  PCR và giải trình tự gen

Những khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch có kanamicin 50 μg/ml là những khuẩn lạc có mang plasmid, chọn vài khuẩn lạc  để kiểm tra bằng PCR với chu trình như trên, điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5% và thang ADN 100 bp để kiểm tra sản phẩm. PCR cho kết quả dương tính với proinsulin thì khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp, được cấy chuyển sang môi trường LB (Luria Bertani) để thu sinh khối, tách plasmid bằng QIAprepSpin  Miniprep  Kit.  Plasmid  tái  tổ  hợp được giải trình tự bằng BigDye terminator v3.1, Applied Biosysterms. Kết quả giải trình tự được đối chiếu với trình tự ở GeneBank sử dụng phần mềm BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Cảm ứng biểu hiện proinsulin và  phân tích bằng SDS-PAGE

Tương tự như tạo dòng E.coli DH5 mang plasmid tái tổ hợp, plasmid tái tổ hợp cũng được biến nạp vào tế bào biểu hiện E.coli BL21 (DE3) (420C/42 giây), sau đó nuôi cấy sàng lọc kiểm tra và được nuôi cấy trong môi trường LB, có bổ xung  kanamicin  (50  μg/ml),  điều  kiện  nuôi  ở 370C,  lắc  200  vòng/phút. Khi  mật  độ  tế  bào A600nm  = 0,8 thì bổ sung chất cảm ứng (IPTG) ở nồng độ 1 mM và để qua đêm nhằm cảm ứng biểu hiện proinsulin.

Thu sinh khối tế  bào và phá  vỡ tế  bào bằng sóng siêu âm trong đệm PBS (Phosphate Buffered Saline), điện di trên gel polyacrylamid 15% có SDS (SDS-PAGE) (Laemmli 1970), có thang chuẩn protein, thu hình ảnh và phân tích kết quả.

Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực

Sắc ký ái lực được thực hiện trên cột 1,0 x 120 cm (Amersham Biosciences) sử dụng ProPond Resin, cân bằng với 250mM NaH2PO4, pH 8.0. Mẫu được hoà tan trong đệm cân bằng và cho qua cột. Phân đoạn gắn được đẩy bằng Imidazole 3M, pH 6.0. Thể tích mỗi phân đoạn là 2 ml, kết quả được kiểm tra bằng OD280nm, và điện di trên SDS- PAGE để phân tích kết quả.